Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, R3712L, BspQI-HF®

Aprenda sobre la fidelidad de la ligasa y supere los límites de las categorías relacionadas Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®), Endonucleasas de restricción B, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Ensamblaje NEBridge® Golden Gate, Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 10 % Tampón NE™ r2.1: 50 % Tampón NE™ r3.1: 25 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 @ 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación dam metilación: No sensible dcm metilación: No sensible CpG metilación: No sensible Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre BspQI-HF y BspQI (R0712)? R: BspQI-HF es la versión de alta fidelidad (HF) de BspQI (R0712). BspQI-HF fue diseñada y seleccionada para una actividad estrella reducida y un alto rendimiento en rCutSmart Buffer a 37 °C. Tiene la misma actividad que BspQI, una endonucleasa de restricción de tipo IIS que reconoce secuencias de ADN asimétricas y escinde fuera de su secuencia de reconocimiento. BspQI está disponible en grado GMP. P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en Golden Gate Assembly? R: El ensamblaje Golden Gate es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada como Time-Saver™ (puede digerir el ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradarlo) y presenta una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Ofrece NEB enzimas de restricción sin BSA o de origen animal para la linealización de plásmidos para el desarrollo de vacunas de ARNm? R: Sí, NEB ha formulado algunas enzimas de restricción (incluida BspQI, un isoesquizómero de SapI) sin componentes de origen animal y no aparece BSA en su formulación final. Además, tenemos varias enzimas de restricción disponibles sin BSA ni otros componentes de origen animal en su formulación final. Esta lista incluye: BbsI-HF BsaI-HFv2 BspQI, isoesquizómero de LguI, grado GMP* ahora disponible BspQI-HF ClaI HindIII-HF PacI SapI SpeI SwaI XbaI XhoI XmnI Se pueden formular otras enzimas a pedido. Por favor, pregunte aquí. * "Grado GMP" y "grado GMP" son términos de marca que NEB utiliza para describir los productos fabricados o terminados en las instalaciones de NEB en Rowley. Las instalaciones de Rowley se diseñaron para fabricar productos bajo una infraestructura y controles de proceso más rigurosos para cumplir con las especificaciones de producto y los requisitos de los clientes más exigentes. Los productos fabricados en las instalaciones de NEB en Rowley se fabrican de conformidad con las normas de sistemas de gestión de calidad ISO 9001 e ISO 13485. Sin embargo, actualmente, NEB no fabrica ni vende productos conocidos como Ingredientes Farmacéuticos Activos (API), ni fabrica sus productos de conformidad con todas las normas vigentes de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM). P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Es compatible el colorante de carga de gel, púrpura (6X) o el colorante de carga de gel, púrpura (6X), sin SDS, con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Debido a que los colorantes de unión a ácidos nucleicos de alta afinidad pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Debido a que el colorante de carga de gel, púrpura (6X) tiene una mayor concentración en SDS, se pueden observar algunas interferencias al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB n.º B7025S) en su lugar. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes SYBR como colorantes prefabricados: reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250 a 500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas reventadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta cuando se usa el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según lo recomendado por el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a ejecutar el gel producirá un resultado deficiente. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60 a 125 ng y use solo 0,5X de colorante GelRed en geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para agregar el colorante GelRed a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a analizar el gel dará como resultado un resultado deficiente. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.