Laboratorios Biológicos de Nueva Inglaterra, R3733L, BsaI-HF®v2

Reactivo de grado GMP también disponible. Categorías relacionadas: Endonucleasas de restricción de alta fidelidad (HF®), Endonucleasas de restricción B, Enzimas de restricción calificadas que ahorran tiempo, Aplicaciones: Ensamblaje NEBridge® Golden Gate, Digestión con enzimas de restricción, Clonación rápida: Acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB. Especificación: Definición de la unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN pXba en 1 hora a 37 °C en un volumen total de reacción de 50 μl. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón NE™ r1.1: 100 % Tampón NE™ r2.1: 100 % Tampón NE™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad del diluyente Diluyente B Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 300 mM TCEP 0,1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante Glicerol al 50 % pH 9 a 25 °C Inactivación por calor a 80 °C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación en presas: no sensible Metilación en dcm: afectada por algunas combinaciones de CpG superpuestos Metilación: bloqueada por algunas combinaciones de CpG superpuestos Preguntas frecuentes P: ¿Cuándo es preocupante la actividad estrella? R: La actividad estrella es preocupante si las bandas adicionales pueden causar una interpretación errónea de los resultados en los procedimientos de genotipado y análisis mutacional. El diseño experimental puede promover la actividad estrella. Es más probable que los volúmenes de reacción pequeños contengan concentraciones de glicerol del 5 % o superiores, una condición que se sabe que aumenta la actividad estrella. Se produce una concentración de glicerol del 5 % cuando se configura una digestión doble en una reacción de 20 µl usando 1 µl de cada enzima. Es más probable que las digestio-noche generen actividad estrella. Para obtener consejos sobre cómo evitar la actividad estrella, haga clic aquí. P: ¿Cuándo debo elegir la versión HF de una enzima? R: La versión HF de la enzima tiene la misma especificidad de escisión que la enzima silvestre y debe elegirse si la actividad estrella es una preocupación o si el tampón recomendado es más conveniente para la digestión doble u otro protocolo de varios pasos. No hay desventajas al usar la versión HF. P: ¿Puede ser ventajoso el cambio en la preferencia de tampón de la enzima HF? R: Todas las enzimas de restricción HF se suministran con el tampón rCutSmart®. Las enzimas HF suelen tener un tampón óptimo diferente al de la enzima silvestre; esto puede ser ventajoso al diseñar experimentos de digestión doble. El tampón rCutSmart se eligió como el tampón recomendado para las enzimas HF, ya que muestra el mayor nivel de compatibilidad enzimática en el sistema de tampón NEB. P: ¿Producirá la enzima HF una actividad estrella elevada al usarse en un tampón diferente al recomendado? R: La actividad estrella se probó exhaustivamente en todos los tampones NE que mostraron al menos un 50% de actividad enzimática. La actividad estrella se reduce significativamente en comparación con la actividad de la enzima silvestre en todos los tampones NEB. Sin embargo, recomendamos usar el tampón de reacción sugerido cuando sea posible, ya que hay casos en los que la actividad estrella puede ser problemática en condiciones extremas con tampones no recomendados. P: ¿Qué significa estar calificado como Time-Saver™? R: Las enzimas calificadas como Time-Saver digieren el sustrato de ensayo unitario en 5-15 minutos en las condiciones de reacción recomendadas y también se pueden usar de forma segura en digestiones nocturnas. P: ¿Tengo que preparar las digestiones con enzimas calificadas como Time-Saver™ durante 5-15 minutos? ¿Puedo digerir durante más tiempo? R: Las enzimas Time-Saver™ de NEB tienen la ventaja de trabajar rápido (5-15 minutos), pero también están diseñadas y calificadas para soportar digestiones nocturnas sin degradar el ADN. P: Probé su enzima de restricción en el ADN sustrato recomendado por NEB y parece estar activa; sin embargo, no digiere mi ADN. ¿Cuál podría ser la razón? R: La calidad y la limpieza del ADN son factores importantes que pueden afectar la actividad enzimática. Las enzimas de restricción activas en el tampón rCutSmart®, pero no tan activas en los tampones NEBuffer r2.1 o r3.1 (nuestros tampones con mayor concentración de sal), pueden ser inhibidas por la sal presente en la reacción. Los procedimientos de purificación de ADN que utilizan columnas de centrifugación pueden generar soluciones de ADN con niveles significativos de sal que pueden transferirse a la reacción e inhibir la actividad enzimática. Para evitarlo, recomendamos que la solución de ADN añadida a la reacción no supere el 25 % del volumen total de reacción. Esto se puede lograr ajustando el volumen total de reacción según corresponda. P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje Golden Gate es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada como Time-Saver™ (puede digerir ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradarlo) y presenta una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en el ensamblaje GoldenBraid? R: BsaI es una enzima de tipo IIS utilizada en este método. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad diseñada de esta enzima, BsaI-HF®v2, que tiene el beneficio adicional de estar calificada para Time-Saver™ (puede digerir ADN en 5-15 minutos y puede digerirse de forma segura durante la noche) y exhibe una actividad estrella reducida. BsaI-HFv2 funciona en el tampón CutSmart®, al igual que la ADN ligasa T4 (también parte del flujo de trabajo GoldenBraid), que es 100% funcionalmente activa en este tampón, cuando la reacción se complementa con 1 mM de ATP. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en GoldenBraid incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BtgZI, BbsI/BbsI-HF y PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb). Referencia: GoldenBraid 2.0: Un marco integral de ensamblaje de ADN para la biología sintética de plantas P: ¿Puede el colorante de carga de gel, púrpura 6X (B7024) almacenarse a bajas temperaturas? R: La temperatura de almacenamiento recomendada para el colorante de carga de gel, púrpura 6X, es temperatura ambiente (25 °C). Comúnmente, el SDS puede precipitar de la solución cuando el colorante se almacena a bajas temperaturas. Este ligero precipitado se puede disipar dejando el vial a temperatura ambiente durante una hora o calentándolo suavemente durante 10 minutos. Mezcle el vial varias veces antes de usarlo para que la solución vuelva a homogeneizarse. P: ¿Cuántos nucleótidos debo agregar junto al sitio de reconocimiento de RE para obtener un corte eficiente? R: Protocolo de digestión con enzimas de restricción: Corte cerca del extremo del ADN. P: ¿Qué enzimas de restricción NEB se suministran con el colorante de carga de gel, púrpura (6X)? R: Todas las enzimas de restricción HF y la mayoría de las enzimas de restricción NEB no HF se suministran con el colorante de carga de gel, púrpura (6X). Las enzimas de restricción no HF que vienen suministradas con el tinte púrpura son: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI SalI XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * Todas las enzimas de restricción HF también se suministran con tinte de carga en gel, morado (6X) P: ¿Cuál es la actividad de ¿La enzima de restricción tipo IIS BsaI-HFv2 (NEB n.° R3733) en el tampón de ADN ligasa T4? R: BsaI-HFv2 presenta una actividad del 100 % en el tampón de ADN ligasa T4. En cambio, BsaI (NEB n.° R0535) solo tiene una actividad del 50 % en el tampón de ADN ligasa T4. P: ¿Es esta enzima sensible a la metilación de DAM, DCM o CpG de mamíferos? R: Sí. Esta enzima no puede cortar los sitios de reconocimiento que se ven afectados por algunas combinaciones de metilación superpuesta de DCM o bloqueados por algunas combinaciones de metilación superpuesta de CpG. Para obtener información actualizada sobre la sensibilidad a la metilación, visite Dam-DCM y metilación de CpG o REBASE. P: ¿Ofrece NEB enzimas de restricción sin BSA ni de origen animal para la linealización de plásmidos para el desarrollo de vacunas de ARNm? R: Sí, NEB ha formulado algunas enzimas de restricción (incluida BspQI, un isoesquizómero de SapI) sin componentes derivados de animales y no aparece BSA en su formulación final. Además, tenemos varias enzimas de restricción disponibles sin BSA ni otros componentes derivados de animales en su formulación final. Esta lista incluye: BbsI-HF BsaI-HFv2 BspQI, isoesquizómero de LguI, grado GMP* ahora disponible BspQI-HF ClaI HindIII-HF PacI SapI SpeI SwaI XbaI XhoI XmnI Se pueden formular otras enzimas a pedido. Por favor, pregunte aquí. * "Grado GMP" y "grado GMP" son términos de marca que NEB utiliza para describir los productos fabricados o terminados en las instalaciones de Rowley de NEB. Las instalaciones de Rowley fueron diseñadas para fabricar productos bajo una infraestructura y controles de proceso más rigurosos para lograr especificaciones de producto y requisitos de los clientes más estrictos. Los productos fabricados en las instalaciones de NEB en Rowley se fabrican de conformidad con las normas de gestión de calidad ISO 9001 e ISO 13485. Sin embargo, actualmente, NEB no fabrica ni vende productos conocidos como Ingredientes Farmacéuticos Activos (API), ni fabrica sus productos de conformidad con todas las normas vigentes de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM). P: ¿Podrían darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEBuffer? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarse de los productos que contienen ingredientes animales es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Son ciertas enzimas de restricción más activas a temperaturas de incubación más altas que las recomendadas? R: Las enzimas de restricción NEB son 100% activas a la temperatura de incubación recomendada en el tampón recomendado que se proporciona con cada enzima. Con algunas enzimas de restricción aisladas de especies termófilas, puede observar una mayor actividad a temperaturas de incubación más altas. No recomendamos aumentar la temperatura, ya que pueden aparecer actividades de nucleasa adicionales a temperaturas no recomendadas. P: ¿Es Gel Loading Dye, Purple (6X) o Gel Loading Dye, Purple (6X), sin SDS compatible con otros colorantes de unión al ADN como SYBR® y GelRed™ durante la electroforesis en gel? R: Debido a que los colorantes de unión a ácidos nucleicos de alta afinidad pueden afectar la migración del ADN durante la electroforesis, se recomienda encarecidamente la tinción posterior de los geles con colorantes SYBR o GelRed. Sin embargo, estos colorantes también se pueden usar como colorantes prefabricados (en el gel de agarosa). Debido a que el colorante de carga de gel, púrpura (6X), tiene una mayor concentración en SDS, se pueden observar algunas interferencias al usar SYBR o GelRed como colorantes prefabricados. Al usar estos colorantes como colorantes prefabricados, NEB recomienda usar nuestro colorante de carga de gel, púrpura, sin SDS (6X) (NEB #B7025S) en su lugar. Siga las siguientes recomendaciones para ambos colorantes púrpura al usar colorantes SYBR como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 250-500 ng y use solo 0,5X de colorantes SYBR en geles prefabricados. Estos colorantes son mucho más sensibles que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a la sobrecarga. Si usa el colorante de carga de gel, púrpura (6X) B7024S, use TBE en lugar del tampón TAE, ya que la interferencia de SDS aumenta al usar el tampón TAE (en el gel y como tampón de ejecución). Use los colorantes SYBR según lo recomendado por el fabricante: agregue primero el colorante SYBR al tampón TBE y luego agregue la mezcla de colorante SYBR/TBE a la solución de agarosa fundida. Es preferible esperar unos minutos para agregar los colorantes SYBR a la agarosa fundida. Agregarlo a una solución de agarosa enfriada (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre ejecute un gel de agarosa recién hecho, para una sola ejecución. Volver a ejecutar el gel producirá un resultado deficiente. Siga las recomendaciones a continuación para ambos colorantes púrpura cuando use colorantes GelRed como colorantes prefabricados: Reduzca la cantidad de ADN de muestra cargado a 60 a 125 ng y use solo 0,5X de colorante GelRed en geles prefabricados. Este colorante es mucho más sensible que el EtBr. Las bandas quemadas o manchadas pueden deberse a una sobrecarga. Es preferible esperar unos minutos para añadir el colorante GelRed a la agarosa fundida. Añadirlo a una solución de agarosa fría (por encima de la temperatura de gelificación, 45 °C) produce mejores resultados. Siempre analice un gel de agarosa recién preparado, para una sola prueba. Repetir la prueba del gel dará resultados deficientes. SYBR® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. GelRed™ es una marca registrada de Biotium.