New England Biolabs, S1427S, columnas de centrifugación NEBExpress® Ni

Categorías relacionadas Purificación de amilosa (etiqueta MBP),, Purificación de níquel (etiqueta His),, Purificación por afinidad, Aplicaciones Etiqueta de afinidad MBP,, Escisión de proteínas de fusión,, Ensayos de pull down, Especificación Tampón de almacenamiento Matriz de soporte de etanol al 20% Micropartículas esféricas basadas en agarosa que varían en tamaño de 10-100 μm. Capacidad de unión Varía según el objetivo, ≥ 1 mg de proteína de fusión etiquetada con His por columna. Preguntas frecuentes P: ¿Cuánto lisado se puede cargar en una sola columna NEBExpress Ni Spin? R: Cada columna puede contener hasta 500 µl de lisado por aplicación y proporciona aproximadamente 1 mg de capacidad de unión disponible. La eficiencia de unión puede variar significativamente entre objetivos y depende del tamaño de la proteína y la accesibilidad de la etiqueta His. Es importante estimar el nivel de expresión de la proteína diana. Esto se puede hacer analizando tanto el lisado como un estándar (de concentración conocida) para cuantificación mediante SDS-PAGE. P: ¿Aumentará la unión prolongada el rendimiento del eluido utilizando las columnas de centrifugación NEBExpress® Ni? R: En algunos casos, prolongar el paso de unión puede resultar en un aumento significativo de la unión de la proteína diana. Tape la columna y selle el fondo con el tapón proporcionado. Mezcle de principio a fin a 4 °C durante el tiempo deseado (normalmente de 5 a 15 minutos, pero puede extenderse durante la noche si es necesario). Sin embargo, tenga en cuenta que una mezcla prolongada también puede resultar en un aumento de la unión inespecífica de proteínas. P: ¿Cuál es el volumen de carga mínimo recomendado? R: El volumen de carga mínimo recomendado es de 50 µl por columna. P: ¿Es necesario tapar la columna durante cada paso de centrifugación? R: No, los pasos de centrifugación pueden realizarse sin tapar la columna. Tapar la columna reduce el caudal, lo que prolonga el tiempo de unión. P: ¿Por qué no se elimina completamente el líquido durante la centrifugación? R: Algunas centrífugas pueden variar en su fuerza centrífuga. También es posible que la variación en la viscosidad del lisado clarificado reduzca la eficiencia de la clarificación durante la centrifugación. El tiempo de centrifugación puede aumentarse de 2 a 5 minutos cuando sea necesario. P: He preparado mi lisado con demasiado tampón y el objetivo está muy diluido, ¿puedo aplicar más lisado repitiendo los pasos de carga? R: Sí, si el volumen del lisado es superior a 500 μl, se pueden realizar múltiples aplicaciones en la misma columna. La unión óptima del objetivo a la resina está relacionada con su concentración; por lo tanto, en algunos casos, si se ha producido una dilución significativa, puede ser necesario preparar un lisado más concentrado para una unión óptima de la proteína objetivo. P: ¿Cómo puedo reducir las proteínas contaminantes en una purificación de proteínas con columna de centrifugación de Ni? R: Añada hasta 10 mM de imidazol al tampón de lisis para evitar la unión de contaminantes (las concentraciones óptimas de imidazol deben determinarse empíricamente). Emplee pasos de lavado adicionales (p. ej., hasta 5 lavados) con el tampón de lavado recomendado. Aumente la concentración de imidazol en el tampón de lavado (pruebe aumentando en incrementos de 5 mM hasta 20 mM); concentraciones más altas de imidazol pueden resultar en una disminución del rendimiento general de la proteína diana. La concentración óptima de imidazol dependerá del objetivo/impureza y, por lo tanto, requerirá optimización. P: ¿Cuáles son las recomendaciones para la elución basada en pH, en contraposición al imidazol? R: Tanto para las purificaciones basadas en imidazol como en pH, la lisis celular debe realizarse en una solución tampón ajustada a pH 7,4, con cloruro de sodio suplementado hasta 0,3 M. Después de la unión, se recomienda un tampón de lavado con un pH de aproximadamente 6,3. La elución puede llevarse a cabo utilizando un tampón con un pH entre 4,5 y 5,2. P: ¿Cómo puedo eliminar el imidazol de una muestra de proteína? R: El imidazol no suele interferir con las aplicaciones posteriores y, por lo tanto, la eliminación es opcional. Hervir una muestra que contiene imidazol antes de la SDS-PAGE puede provocar la hidrolización de los enlaces lábiles a los ácidos. En su lugar, se recomienda incubar la muestra a 70 °C durante 5 min en tampón de carga SDS antes del análisis. Si es necesario eliminar el imidazol, este puede eliminarse mediante diálisis, precipitación con sulfato de amonio, ultrafiltración o utilizando una columna de desalinización por exclusión de tamaño. P: ¿Cuáles son las ventajas de realizar la purificación en condiciones desnaturalizantes? R: La decisión de purificar una proteína con etiqueta His en condiciones desnaturalizantes o nativas depende de la ubicación y solubilidad de la proteína, la accesibilidad de la etiqueta His y si la actividad biológica debe conservarse para aplicaciones posteriores. La purificación en condiciones desnaturalizantes se emplea con mayor frecuencia cuando la estructura terciaria de la proteína nativa secuestra la etiqueta His, lo que hace que la purificación en condiciones nativas sea ineficaz, o para solubilizar cuerpos de inclusión. Las condiciones desnaturalizantes también pueden mitigar la actividad de las enzimas proteolíticas, reduciendo el riesgo de degradación de la proteína diana durante la purificación. P: ¿Cómo puedo determinar si mi proteína diana permanece unida a la resina? R: Añada 200 µl de tampón de carga SDS-PAGE a la columna, pipetee verticalmente y extraiga una alícuota de la resina de la columna de centrifugación. Incube a 70 °C durante 5 minutos para liberar cualquier proteína que quede en la resina después de la elución. Cargue y analice las proteínas mediante SDS-PAGE. La mayoría de las proteínas, independientemente de si se unen al níquel o a la propia perla de agarosa, se recuperarán mediante este procedimiento. P: ¿Por qué no es necesario el imidazol en el tampón de lisis/unión? ¿Por qué el tampón de lavado contiene solo 5 mM de imidazol? R: Las columnas de centrifugación NEBExpress™ Ni utilizan una resina patentada altamente selectiva que, a diferencia de las Ni-NTA convencionales, requiere menos imidazol en la purificación. Los iones de níquel se inmovilizan en la superficie de la matriz a través de un ligando patentado que es altamente uniforme y estable y ofrece una excelente resistencia a una amplia gama de productos químicos, incluidos NaOH, EDTA, DTT y β-ME.