New England Biolabs, S1428S, resina NEBExpress® Ni

Categorías relacionadas: Purificación de amilosa (etiqueta MBP), Sistema de fusión y purificación NEBExpress MBP, Expresión de proteínas bacterianas de E. coli, Aplicaciones: Etiqueta de afinidad MBP, Escisión de proteínas de fusión, Ensayos pull-down, Especificación: Tampón de almacenamiento : Matriz de soporte de etanol al 20 %. Micropartículas esféricas a base de agarosa con un tamaño de 10 a 100 μm. Capacidad de unión: 1 ml de resina de níquel NEBExpress™ unirá ≥ 10 mg de proteína de fusión marcada con His. Preguntas frecuentes : P: ¿Se puede utilizar la resina de níquel NEBExpress® en sistemas de purificación presurizados a gran escala, como la FPLC? R: Sí, la resina de níquel NEBExpress® es una excelente opción para la purificación a gran escala en estos sistemas automatizados. Las siguientes pautas se recomiendan para su uso en un sistema automatizado y presurizado: Las columnas deben empaquetarse a una presión constante de aproximadamente 1 bar (0,1 MPa) o una velocidad de flujo de empaquetamiento de aproximadamente 400 cm/h (altura de lecho de 10 cm, 25 °C, tampón de baja viscosidad). La presión máxima que la resina puede soportar es de 3 bar (0,3 MPa). P: ¿Es necesario regenerar la resina de níquel NEBExpress con níquel después de la limpieza? R: No, la resina está compuesta por una matriz de níquel altamente estable que minimiza la fuga de iones de níquel y elimina la necesidad de regeneración de níquel incluso después de ciclos repetitivos de limpieza in situ (CIP). Consulte los protocolos de reacción típicos para conocer los procedimientos CIP recomendados. P: ¿Cómo puedo reducir las proteínas contaminantes en una purificación de proteínas cuando uso resina de níquel? R: Añada hasta 10 mM de imidazol al tampón de lisis para evitar que los contaminantes se unan (las concentraciones óptimas de imidazol deben determinarse empíricamente). Emplee pasos de lavado adicionales (p. ej., hasta 5 volúmenes de columna adicionales) con el tampón de lavado recomendado. Aumente la concentración de imidazol en el tampón de lavado (pruebe aumentando en incrementos de 5 mM hasta 20 mM); concentraciones más altas de imidazol pueden resultar en una disminución del rendimiento general de la proteína diana. La concentración óptima de imidazol dependerá del objetivo/impureza y, por lo tanto, requerirá optimización. Si sospecha que hay contaminantes asociados con la proteína de fusión His-tag, agregue 10 mM de β-mercaptoetanol o 1 mM de THP para reducir los enlaces disulfuro. Aumente las concentraciones de sal y/o detergente o agregue etanol/glicerol al tampón de lavado para interrumpir las interacciones no específicas. Los contaminantes también pueden surgir como formas truncadas de la proteína de fusión His-tag, verifique posibles inicios de traducción interna (His-tag C-terminal) o sitios de terminación prematura (His-tag N-terminal). Evite la degradación de la proteína durante la purificación manteniendo la resina fría (4 °C) o incluyendo inhibidores de proteasa. P: ¿Cuáles son las recomendaciones para la elución basada en pH, en comparación con la de imidazol? R: Tanto para las purificaciones con imidazol como con pH, la lisis celular debe realizarse en una solución tamponada ajustada a pH 7,4, con cloruro de sodio suplementado hasta 0,3 M. Tras la unión, se recomienda un tampón de lavado con un pH aproximado de 6,3. La elución puede realizarse utilizando un tampón con un pH entre 4,5 y 5,2. P: ¿Cómo puedo eliminar el imidazol de una muestra de proteína? R: El imidazol no suele interferir con las aplicaciones posteriores, por lo que su eliminación es opcional. Hervir una muestra que contiene imidazol antes de la SDS-PAGE puede provocar la hidrolización de los enlaces lábiles en presencia de ácido. En su lugar, se recomienda incubar la muestra a 70 °C durante 5 minutos en tampón de carga de SDS antes del análisis. Si es necesario eliminar el imidazol, se puede hacer mediante diálisis, precipitación con sulfato de amonio, ultrafiltración o utilizando una columna de desalinización por exclusión de tamaño. P: ¿Cuáles son las ventajas de realizar la purificación en condiciones desnaturalizantes? R: La decisión de purificar una proteína con etiqueta His en condiciones desnaturalizantes o nativas depende de la ubicación y solubilidad de la proteína, la accesibilidad de la etiqueta His y si la actividad biológica debe conservarse para aplicaciones posteriores. La purificación en condiciones desnaturalizantes se emplea con mayor frecuencia cuando la estructura terciaria de la proteína nativa secuestra la etiqueta His, lo que hace que la purificación en condiciones nativas sea ineficiente, o para solubilizar cuerpos de inclusión. Las condiciones desnaturalizantes también pueden mitigar la actividad de las enzimas proteolíticas, reduciendo el riesgo de degradación de la proteína diana durante la purificación. P: ¿Cómo puedo determinar si mi proteína diana permanece unida a la resina? R: Añada 200 µl de tampón de carga SDS-PAGE a la columna, pipetee verticalmente y extraiga una alícuota de la resina de la columna de centrifugación. Incube a 70 °C durante 5 minutos para liberar cualquier proteína que quede en la resina después de la elución. Cargue y analice proteínas mediante SDS-PAGE. La mayoría de las proteínas, independientemente de si se unen al níquel o a la propia perla de agarosa, se recuperarán mediante este procedimiento. P: ¿Por qué no es necesario el imidazol en el tampón de lisis/unión? ¿Por qué el tampón de lavado contiene solo 5 mM de imidazol? R: La resina de Ni NEBExpress utiliza una resina patentada altamente selectiva que requiere menos imidazol durante la purificación en comparación con las resinas convencionales basadas en Ni NTA. La concentración óptima de imidazol dependerá del objetivo/impureza y, por lo tanto, deberá optimizarse. P: ¿Por qué mi proteína precipita en la columna? R: Es posible que la proteína forme agregados o que la temperatura sea demasiado baja. La precipitación se puede reducir ejecutando la purificación a temperatura ambiente, realizando la unión en modo batch para reducir la alta concentración local de proteína y/o agregando reactivos de solubilización a los buffers de trabajo (es decir, 0.1% Triton X-100 o Tween20, < 10 mM β-Mercaptoetanol, hasta 2 M NaCl o cofactores como Mg2+). P: ¿Qué columna de gravedad recomiendan? R: Recomendamos la línea de columnas Econo de 2.5 cm (diámetro interno) de Bio-Rad o la Kontes Flex-Column. Los tamaños de columna (diámetro interno y longitud) se pueden aumentar o disminuir y deben basarse en la cantidad de resina necesaria para aislar la proteína de interés en rendimientos suficientes. P: ¿La unión extendida aumentará el rendimiento en el eluido usando columnas NEBExpress® Ni Spin? R: En algunos casos, extender el paso de unión puede resultar en un aumento significativo de la unión de la proteína objetivo. Tape la columna y selle la parte inferior usando el tapón provisto. Mezcle de principio a fin a 4 °C durante el tiempo deseado (normalmente de 5 a 15 minutos, pero puede extenderse durante la noche si es necesario). Sin embargo, tenga en cuenta que una mezcla prolongada también puede aumentar la unión a proteínas no específicas.