Kit de minipreparación de plásmido giratorio Monarch®, T1110L, de New England Biolabs

Categorías relacionadas Purificación de plásmidos, Aplicaciones de purificación de ácidos nucleicos Preguntas frecuentes sobre purificación de ácidos nucleicos P: ¿Puedo comprar columnas Monarch y tubos de recolección por separado? R: Sí, las columnas y los tubos de recolección (NEB n.° T1117) para el kit Monarch Spin Plasmid Miniprep se venden por separado. P: ¿Puedo usar agua para eluir el ADN cuando uso el kit Monarch Spin Plasmid Miniprep? R: Sí, se puede usar agua para eluir ADN de las columnas Monarch. Para una máxima eficiencia de elución, asegúrese de que el agua esté libre de nucleasas y que el pH esté entre 7 y 8,5. El agua Milli-Q™ suele ser ligeramente ácida, lo que requiere un ajuste de pH. Si va a almacenar el ADN a largo plazo, recomendamos usar el tampón de elución de ADN suministrado, que contiene 0,1 mM de EDTA y puede ayudar a inhibir las nucleasas dependientes de metales. P: Para el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110), ¿qué medio de cultivo recomienda para el cultivo de E. coli? R: Sugerimos usar medios LB (Luria-Bertani) para el cultivo de E. coli. También se pueden usar medios ricos como 2X YT o Terrific Broth, pero suelen producir densidades celulares significativamente mayores en saturación. Por lo tanto, es necesario reducir la cantidad de cultivo procesado con medios ricos para evitar una lisis alcalina insuficiente y la sobrecarga de la columna debido a una mayor biomasa. P: ¿Qué cepa(s) de E. coli se recomiendan para usar con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110)? R: La mayoría de las cepas de clonación de laboratorio estándar se pueden usar como hospedadores para propagar plásmidos para la purificación mediante minipreparación. Las cepas adecuadas disponibles en NEB incluyen NEB 10-beta (NEB n.° C3019), NEB 5-alfa (NEB n.° C2987), NEB Turbo (NEB n.° C2984) y NEB Stable (NEB n.° C3040). Puede ser beneficioso evitar cepas como la HB101 o la serie JM100, que contienen altas cantidades de carbohidratos que pueden interferir con los pasos enzimáticos posteriores. P: ¿Qué condiciones de cultivo recomiendan para un rendimiento óptimo con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110)? R: Los cultivos deben inocularse a partir de una sola colonia y cultivarse en presencia de un antibiótico adecuado durante todo el cultivo. Se pueden realizar subcultivos a partir de cultivos iniciadores, pero los resultados pueden variar. Las células deben recolectarse a medida que el cultivo pasa de la fase logarítmica a la estacionaria para garantizar la mayor cantidad de ADN plasmídico presente con poca lisis celular. En flujos de trabajo de clonación rutinarios con plásmidos de medio a alto número de copias, se puede usar una sola colonia para inocular un cultivo de 5-10 ml cultivado a 37 °C durante 12-16 horas. El procesamiento de 1-3 ml de este cultivo debería producir de 3 a 6 μg de un plásmido con un alto número de copias o de 1 a 2 μg de un plásmido con un número medio de copias. Los plásmidos con un número menor de copias producirán rendimientos menores, lo cual puede solucionarse procesando volúmenes de cultivo mayores con el escalado simultáneo de los tampones B1-B3 o mediante la concentración del ADN purificado. P: ¿Cómo puedo evitar la contaminación por ARN en muestras de ADN al utilizar el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110)? R: Para evitar la contaminación por ARN en sus muestras de ADN al utilizar el nuevo kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110), es importante utilizar la ARNasa A según las instrucciones del protocolo. La ARNasa A debe añadirse al tampón Monarch B1 (tampón de resuspensión, rosa) para garantizar la concentración correcta. Almacene el tampón a 4 °C después de agregar la ARNasa A. Durante el proceso de purificación del plásmido, en el paso donde se agrega el tampón B3 (tampón de neutralización, amarillo), asegúrese de que la muestra esté bien mezclada y déjela incubar durante el tiempo recomendado para permitir la degradación del ARN. Para volúmenes de cultivo bacteriano superiores a 3 ml, aumente el tiempo de centrifugación después de agregar el tampón de neutralización a 5 minutos para permitir más tiempo para que la ARNasa digiera el ARN. P: ¿Cuál es el volumen mínimo de tampón de elución que se puede usar con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.º T1110)? R: El protocolo está optimizado para proporcionar buenos rendimientos con un volumen de elución tan bajo como 30 μl de tampón de elución. Se pueden usar cantidades menores para aumentar la concentración, pero el rendimiento general se reducirá debido a la humectación incompleta de la membrana. También se pueden usar volúmenes de elución mayores, pero el ADN eluido tendrá una concentración menor. P: ¿Cuál es la composición de cada tampón incluido en el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110)? R: La composición de los tampones es exclusiva. Sin embargo, podemos compartir lo siguiente: Monarch Buffer B1 (tampón de resuspensión): tampón de resuspensión basado en Tris Monarch Buffer B2 (tampón de lisis): tampón de lisis basado en hidróxido de sodio y SDS Monarch Buffer B3 (tampón de neutralización): tampón de neutralización basado en clorhidrato de guanidina Monarch Buffer BZ (tampón de lavado 1): tampón de lavado basado en guanidina/isopropanol Monarch Buffer WZ (tampón de lavado 2): tampón de lavado basado en etanol Monarch Buffer EY (tampón de elución): tampón de elución Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,5 P: Cuando uso el Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB n.º T1110), ¿por qué podría observar una mancha sobre la banda del plásmido en un gel de agarosa? R: La presencia de una mancha con un peso molecular superior al de la banda del plásmido puede indicar que el ADN genómico está contaminando la preparación del plásmido. Si bien esto es poco común, el ADN genómico puede cizallarse durante la lisis y copurificarse con el plásmido. La agitación vigorosa o el vórtex después de añadir el tampón B2 probablemente producirán ADN genómico cizallado y deben evitarse. Si el lisado es muy viscoso y no se mezcla bien, comience con menos células para la minipreparación. P: Al utilizar el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110), ¿qué explicaría las bandas adicionales que veo en el gel? R: La forma predominante del ADN producido debería ser superenrollado, que suele tener una movilidad más rápida durante la electroforesis en gel de agarosa que un plásmido lineal. Además de estas dos formas, también podría observar: una forma monocatenaria abierta con pesos moleculares inferiores a la forma superenrollada. Esto se debe a una lisis alcalina excesiva, que provoca la desnaturalización del plásmido. Una forma mellada o relajada, denominada circular abierta, que normalmente migra a una posición superior a la de la forma lineal. Concatémeros o multímeros de plásmidos con pesos moleculares incluso mayores. Las posiciones relativas de estas bandas pueden diferir en los tampones TAE frente a TBE. P: ¿Qué factores afectan a la recuperación del ADN plasmídico al utilizar el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.º T1110)? R: Existen factores, tanto antes como durante la preparación, que pueden afectar a la recuperación del plásmido. El número de copias del plásmido, el tamaño del plásmido, la toxicidad del inserto, la cepa huésped, la selección de antibióticos, los medios de crecimiento y las condiciones de cultivo pueden afectar a la recuperación del plásmido en etapas posteriores. Características del plásmido: el número de copias del plásmido, el tamaño y la toxicidad del inserto afectan directamente a la cantidad de plásmido contenida en cada célula. Para obtener mayores rendimientos, elija plásmidos con un alto número de copias cuando sea adecuado, especialmente para plásmidos ≤ 10 kb. Se pueden aislar plásmidos más grandes, de hasta 25 kb, pero el rendimiento se verá reducido. Cepa hospedadora y condiciones de cultivo: La elección de la cepa hospedadora, la selección de antibióticos, el medio de cultivo y las condiciones de cultivo son cruciales. Mantener la selección de antibióticos durante el crecimiento garantiza que el plásmido no se pierda y evita que el cultivo sea superado por una población de células de crecimiento más rápido sin plásmido. Una aireación y una temperatura de crecimiento adecuadas garantizan que las células crezcan logarítmicamente con poca lisis celular. Procedimiento de preparación: Es fundamental utilizar la cantidad adecuada de células y seguir el protocolo. Desviarse de la guía para "aumentar el rendimiento" suele resultar en una reducción del rendimiento y la calidad del ADN. Asegúrese de que el pellet bacteriano esté completamente resuspendido (sin grumos visibles) antes de añadir el tampón Monarch B2 para la lisis alcalina, que desnaturaliza tanto el ADN cromosómico como el plasmídico. Neutralización: Asegúrese de que la neutralización sea completa tras la adición del tampón Monarch B3 y de que el ADN plasmídico se haya renaturalizado comprobando que la solución esté completamente amarilla antes de la centrifugación. Una neutralización incompleta puede provocar que los restos celulares (proteína/ADN cromosómico/membrana celular) no se sedimenten en el fondo del tubo, lo que dificulta la recuperación del sobrenadante. Tenga cuidado de no transferir restos celulares que puedan obstruir la columna Monarch. P: ¿Qué factores afectan mi (A260/280) después de realizar una minipreparación de plásmidos con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110)? R: Durante una minipreparación de plásmidos, la relación A260/280 indica la pureza relativa del ADN eluido comparando la absorbancia a 260 nm, donde los ácidos nucleicos presentan máximas de absorbancia, con la de 280 nm, donde las proteínas presentan máximas de absorbancia. Una neutralización ineficaz o un lavado insuficiente pueden permitir que el exceso de proteína permanezca asociado a la matriz y eluya con el ADN. El uso del tampón de elución suministrado para eluir la muestra y el blanco del espectrofotómetro garantizará que no se produzcan cambios en la relación 260/280 debido a la acidez de la muestra. Si se utiliza agua para eluir el ADN, utilice la misma agua que se utilizó como blanco en el espectrofotómetro. P: ¿Qué factores afectan mi (A260/230) después de realizar una minipreparación de plásmidos con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.º T1110)? R: Los componentes del medio y algunos componentes celulares pueden reducir la relación A260/A230. Seguir el protocolo garantizará la eliminación de estos contaminantes. Además, algunas partículas pueden eluir con el ADN, lo que afecta a la relación. En este caso, realice un centrifugado adicional de 15 segundos del ADN eluido para sedimentar las partículas antes de la evaluación por espectrometría (Nanodrop®). Retirar la muestra de ADN de la parte superior de la muestra puede ayudar a evitar la transferencia de partículas. P: ¿Cuál es la capacidad máxima de unión de la columna Monarch Plasmid Miniprep? R: La matriz suministrada en cada columna es suficiente para unir 20 microgramos de ADN purificado en las condiciones de prueba. Al realizar una minipreparación, se introducen componentes celulares como carbohidratos, proteínas y ácido nucleico residual del huésped; todos estos pueden competir por la unión a la matriz y afectar la recuperación del ADN plasmídico. P: ¿Qué debo hacer de forma diferente al utilizar un plásmido de bajo número de copias? R: La recuperación de plásmidos de bajo número de copias siempre es menor en comparación con los plásmidos de alto número de copias. Asegurarse de que el cultivo se desarrolle con la aireación adecuada y se coseche antes de que se produzca una lisis celular significativa aumentará el número de células intactas que albergan el plásmido. El uso de más células puede compensar parte de la deficiencia, pero respete las directrices proporcionadas para garantizar que la lisis alcalina sea eficiente y que la columna no se sobrecargue con componentes celulares. Consulte también nuestras directrices para trabajar con plásmidos de bajo número de copias y nuestra nota de aplicación sobre la eliminación de ADN genómico al trabajar con plásmidos de bajo número de copias. P: ¿Los colorantes del tampón del kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110) afectan a las aplicaciones de ADN posteriores? R: No, el ADN purificado se ha probado en diversas aplicaciones, como la digestión con enzimas de restricción, la secuenciación de ADN, la PCR de punto final y la transfección de células de mamíferos, y no presenta ningún problema para aplicaciones posteriores. P: ¿Puedo usar ADN aislado del kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110) para la transfección? R: Sí. Hemos transfectado con éxito plásmidos preparados con nuestro kit en líneas celulares HEK 293 utilizando el reactivo Lipofectamine 3000, con una eficiencia similar a la de los principales proveedores de minipreparaciones del mercado. P: ¿Son las columnas de centrifugación Monarch compatibles con los colectores de vacío? R: Hemos validado las columnas de los siguientes kits Monarch para su uso en colectores de vacío de sobremesa comunes: Kit de minipreparación de plásmidos (NEB n.° T1010), Kit de extracción de gel de ADN (NEB n.° T1020), Kit de limpieza de PCR y ADN (NEB n.° T1030) y Kits de limpieza de ARN (NEB n.° T2030, T2040, T2050). Los colectores de vacío se pueden utilizar con otras columnas Monarch, pero pueden requerir optimización o tiempo adicional para que el líquido fluya completamente. P: ¿Puede el Kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110) garantizar la recuperación de ADN plasmídico sin endotoxinas? R: Aunque el tampón Monarch WZ (tampón de lavado 1) elimina la mayor parte de las endotoxinas de la muestra, no se puede garantizar que el ADN recuperado esté completamente libre de endotoxinas. Dicho esto, hemos utilizado con éxito el ADN plasmídico recuperado con nuestros kits para transfectar líneas celulares robustas. Aunque otros proveedores afirman que sus kits de minipreparaciones están libres de endotoxinas, generalmente contienen endotoxinas. P: ¿Por qué se producen bajos rendimientos de ADN plasmídico o altos niveles de ADN genómico contaminante (ADNg) al utilizar 5 ml de cultivo celular para el aislamiento de plásmidos con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.° T1110) y cómo se puede mejorar? R: Un rendimiento menor al utilizar cultivos celulares de 5 ml puede indicar que se utilizaron demasiadas células en el aislamiento del plásmido. Si bien recomendamos que nuestro kit admita hasta 5 ml de cultivo (≤OD 15), en algunos casos la densidad celular es demasiado alta con este volumen. Usar demasiadas células puede provocar una lisis celular incompleta, una menor eliminación del ADNg del huésped y un menor rendimiento. Además, la lisis de demasiadas células producirá un exceso de restos celulares y ADNg contaminante que puede saturar la columna y disminuir su capacidad para unirse al ADN plasmídico. Si el cultivo celular se cosecha después de la transición a la fase estacionaria, usar un menor volumen de cultivo celular en el aislamiento puede proporcionar mejores rendimientos. Dividir el cultivo de 5 ml por la mitad y procesarlo en dos columnas probablemente producirá mejores resultados. Como alternativa, duplicar los volúmenes de resuspensión, lisis y neutralización puede permitir un mejor rendimiento de la columna, pero requerirá cargarla dos veces, cada vez con la mitad de la muestra neutralizada. P: ¿Se pueden usar los componentes del antiguo Monarch® Plasmid Miniprep Kit (NEB n.° T1010) indistintamente con los de la nueva versión del kit (Monarch Spin Plasmid Miniprep Kit, NEB n.° T1110)? R: Sí, aunque la nueva versión del Monarch Spin Plasmid Miniprep Kit se ha desarrollado con mejoras tanto en la columna física como en la química del tampón, los componentes de la versión anterior son compatibles con el kit actualizado. El ADN plasmídico purificado mantendrá su alta calidad y será adecuado para diversas aplicaciones posteriores; sin embargo, en algunos casos, puede haber variaciones de hasta un 20 % en el rendimiento. P: Antes de usar, ¿cómo debo preparar los tampones? ¿Debo agregar isopropanol o etanol a los tampones antes de usarlos? R: Sí, es necesario agregar isopropanol y etanol a los tampones Monarch BZ y Monarch WZ antes de usarlos. La ARNasa Monarch A debe agregarse al tampón Monarch B1 antes de usarlo y luego el tampón debe almacenarse a 4 °C. Consulte la Guía de preparación de tampones (NEB n.° T1110) con instrucciones específicas para los kits sobre cómo preparar estos tampones para su uso. P: Noto que estoy aplicando fuerza para encajar la columna en un tubo de recolección. ¿Debería hacerlo? ¿Qué tubos de recolección son compatibles con las columnas? R: Todos los kits Monarch® incluyen tubos de recolección compatibles para las columnas de centrifugación. Si utiliza tubos de recolección fuera de un kit determinado, utilice los tubos de recolección Monarch® Spin Collection Tubes (NEB n.° T2118). No fuerce ninguna columna en tubos de recolección no recomendados que tengan un ajuste muy ajustado para evitar dañar la columna. P: Veo residuos de sílice en mi columna Monarch. ¿Es esto un problema? R: No, no es un problema. La presencia de residuos o partículas de sílice en la columna de purificación de ácidos nucleicos no afecta la unión ni la pureza de los ácidos nucleicos. Nuestras columnas están diseñadas para retener las fibras de sílice, lo que ayuda a garantizar que no se depositen en el eluido final. P: Las enzimas del kit no se almacenaron a -20 °C inmediatamente. ¿Seguirán funcionando? R: Sí, la Monarch RNase A sin abrir es estable a temperatura ambiente a corto plazo. Una vez abierta, la Monarch RNase A debe almacenarse a -20 °C.