Columnas de centrifugación Monarch® S2D y tubos T1117L de New England Biolabs

Categorías relacionadas Purificación de plásmidos, Aplicaciones de purificación de ácidos nucleicos Preguntas frecuentes sobre purificación de ácidos nucleicos P: ¿Cuál es el volumen mínimo de tampón de elución que se puede utilizar con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.º T1110)? R: El protocolo está optimizado para proporcionar buenos rendimientos con un volumen de elución tan bajo como 30 μl de tampón de elución. Se pueden utilizar cantidades menores para aumentar la concentración, pero el rendimiento general se reducirá debido a la humectación incompleta de la membrana. También se pueden utilizar volúmenes de elución mayores, pero el ADN eluido tendrá una concentración menor. P: He utilizado 5 ml de cultivo celular para el aislamiento de plásmidos con el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB n.º T1110) y estoy obteniendo bajas cantidades de plásmido o ADNg contaminante. ¿A qué se debe esto y cuáles son sus sugerencias para mejorar el rendimiento y la pureza? R: Un rendimiento menor al utilizar cultivos celulares de 5 ml puede indicar que se utilizaron demasiadas células en el aislamiento del plásmido. Aunque recomendamos que nuestro kit admita hasta 5 ml de cultivo (≤OD 15), en algunos casos la densidad celular es demasiado alta con este volumen. Usar demasiadas células puede provocar una lisis celular incompleta, una menor eliminación del ADNg del huésped y un menor rendimiento debido a un volumen insuficiente de tampón Monarch B2 (tampón de lisis) utilizado en el protocolo estándar. Además, la lisis de demasiadas células producirá un exceso de restos celulares y ADNg contaminante que puede saturar la columna y disminuir su capacidad para unirse al ADN plasmídico. Si el cultivo celular se recolecta después de la transición a la fase estacionaria, usar un menor volumen de cultivo celular en el aislamiento puede proporcionar mejores rendimientos. Dividir el cultivo de 5 ml por la mitad y procesarlo en dos columnas probablemente producirá mejores resultados. Como alternativa, duplicar los volúmenes de resuspensión, lisis y neutralización puede permitir un mejor rendimiento de la columna, pero requerirá cargarla dos veces, cada vez con la mitad de la muestra neutralizada. P: ¿Los tubos de recolección forman parte del paquete de la columna de centrifugación Monarch® S2D y tubos (NEB n.° T1117L) o deben comprarse por separado? R: La columna de centrifugación Monarch S2D y tubos (NEB n.° T1117L) se vende con los tubos de recolección como un conjunto. Recibirá 100 columnas de centrifugación y 100 tubos de recolección. Sin embargo, también puede comprar solo los tubos de recolección (NEB n.° T2118). P: Noto que estoy aplicando fuerza para encajar la columna en un tubo de recolección. ¿Debería hacerlo? ¿Qué tubos de recolección son compatibles con las columnas? R: Todos los kits Monarch® incluyen tubos de recolección compatibles para las columnas de centrifugación. Si utiliza tubos de recolección fuera de un kit determinado, utilice los tubos de recolección Monarch® Spin Collection Tubes (NEB n.° T2118). No fuerce ninguna columna en tubos de recolección no recomendados que estén muy ajustados para evitar dañar la columna. P: Veo residuos de sílice en mi columna Monarch. ¿Es esto un problema? R: No, esto no supone un problema. La presencia de residuos o partículas de sílice en la columna de purificación de ácidos nucleicos no afecta la unión ni la pureza de los ácidos nucleicos. Nuestras columnas están diseñadas para retener las fibras de sílice, lo que ayuda a garantizar que no se depositen en el eluido final.