Kit de limpieza de ARN Monarch® Spin de New England Biolabs, T2030S (10 μg)

A partir del 24 de septiembre de 2024, el nombre del producto se cambió a Monarch. Categorías relacionadas : Limpieza de ARN, Extracción y purificación de ARN, Purificación de ácidos nucleicos. Preguntas frecuentes : P: ¿Cuál es la composición de cada tampón incluido en los kits de limpieza de ARN Monarch Spin? R: La composición de los tampones es exclusiva. Sin embargo, podemos compartir la siguiente información: Tampón Monarch BX..................Tampón de unión a base de guanidina. Tampón Monarch WX.......................Tampón de lavado a base de etanol. P: ¿Cuál es la capacidad máxima de unión de la columna para la limpieza de ARN incluida en el kit de limpieza de ARN Monarch Spin? A: Aunque en algunos casos se han observado mayores rendimientos, la matriz suministrada en cada columna es suficiente para unir las siguientes cantidades de ARN: T2030/T2037: 10 µg de ARN T2040/T2047: 50 µg de ARN T2050/T2057: 500 µg de ARN Es importante tener en cuenta que las reacciones enzimáticas introducen componentes como detergentes, colorantes, proteínas y nucleótidos, todos los cuales pueden competir por la unión a la membrana durante la limpieza y afectar la recuperación del ARN. P: ¿Cuál es el volumen más pequeño de agua libre de nucleasas que se puede usar para la elución con las columnas Monarch Spin S1A, S2A, S2B para la limpieza del ARN? R: T2030/T2037: 6 µl; los volúmenes de elución típicos son 6-20 µl T2040/T2047: 20 µl; Los volúmenes de elución típicos son de 20 a 50 µl para T2050/T2057: 50 µl; los volúmenes de elución típicos son de 50 a 100 µl. El uso de volúmenes de elución menores probablemente resultará en varianza debido a una humectación inconsistente de la matriz. El rendimiento puede aumentar ligeramente si se utiliza un volumen mayor, pero el ARN estará menos concentrado. *Se puede realizar una segunda elución para maximizar la recuperación del ARN. Esta segunda elución se puede realizar utilizando una alícuota fresca de agua libre de nucleasas o el eluyente de la primera elución para maximizar la recuperación y minimizar el volumen. Recuperación de ARN a partir de kits de limpieza de ARN Monarch Spin con volúmenes de elución variables. El ARNr (10, 50 o 500 µg, respectivamente, de estándar ribosomal 16S y 23S de E. coli, Sigma) se purificó utilizando un kit de limpieza de ARN Monarch Spin (10 µg, NEB n.° T2030), 50 µg, NEB n.° T2040 y 500 µg, NEB n.° T2050). Se utilizó agua libre de nucleasas para eluir el ARN. El porcentaje de recuperación del ARN se calculó a partir del A260 resultante, medido con un Trinean DropSense 16. Aproximadamente el 80 % del ARN se puede recuperar de forma eficiente en 6 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (10 µg, NEB n.º T2030), 20 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg, NEB n.º T2040) y 50 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (500 µg, NEB n.º T2050). P: ¿Puedo obtener una mejor recuperación con los kits de limpieza de ARN Monarch Spin si realizo una segunda elución con el eluyente de la primera elución? R: Se puede realizar una segunda elución para maximizar la recuperación del ARN. Esta segunda elución se puede realizar utilizando una alícuota fresca de agua sin nucleasas o el eluyente de la primera elución para maximizar la recuperación y minimizar el volumen. P: ¿Qué factores afectan mi (A260/A230) al usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin? R: La guanidina y el etanol, ambos introducidos durante la preparación, pueden reducir la proporción A260/A230. Seguir el protocolo, especialmente los pasos de lavado, garantizará la eliminación de estos componentes. P: ¿Qué tamaño de ARN se puede purificar con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin? R: Con el protocolo estándar, se pueden purificar ARN ≥ 25 nt. Con una ligera modificación en el protocolo (añadir 2 volúmenes de etanol en lugar de 1 volumen después de añadir el tampón de unión), se puede purificar ARN > 15 nt. Recuperación de ARN pequeños con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin. Los oligonucleótidos de ARN sintetizados (1 μg en 50 μl de H₂O) de longitudes variables (15–100 nt) se purificaron con el kit Monarch Spin RNA Cleanup (NEB n.° T2040) y se eluyeron en 50 μl de agua sin nucleasas. El porcentaje de recuperación de ARN Spin se calculó a partir de la A260 resultante, medida con un Trinean DropSense™ 16. El protocolo estándar del kit Monarch Spin RNA Cleanup resulta en una recuperación y limpieza >70 % de ARN ≥ 25 nt, mientras que el uso del kit Monarch Spin RNA Cleanup con el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol en el paso 2) resulta en una recuperación y limpieza >70 % de ARN incluso más pequeños (de hasta 15 nt). Tenga en cuenta que la recuperación de ARN pequeños (< 45 nt) puede verse afectada por la secuencia, las interacciones con otros ácidos nucleicos o la estructura secundaria. La estructura secundaria afecta la recuperación de ARN pequeños (<45 nt). Los oligonucleótidos de ARN sintetizados (1 μg en 50 μl de H2O) de longitudes variables (25-40 nt) y con estructura secundaria prevista variable* se purificaron utilizando el kit de limpieza de ARN Spin Monarch (NEB n.º T2040) y se eluyeron en 50 μl de agua sin nucleasas. El porcentaje de recuperación del ARN se calculó a partir de la A260 resultante, medida con un Trinean DropSense™ 16. Los ARN pequeños (25-40 nt) con baja estructura secundaria prevista se recuperaron de forma eficiente utilizando el protocolo estándar del kit de limpieza de ARN Spin Monarch. Sin embargo, los niveles elevados de estructura secundaria reducen la recuperación de ARN pequeños (25-40 nt de longitud). La recuperación normalmente se puede aumentar a >70 % (línea naranja) utilizando el kit de limpieza de ARN Spin Monarch con el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol en el paso 2). *La estructura secundaria se predijo utilizando el servidor web RNAstructure: Reuter, JS y Mathews, DH (2010). RNAstructure: software para la predicción y el análisis de la estructura secundaria del ARN. BMC Bioinformatics. 11,129 Si se observa un bajo rendimiento de un ARN pequeño utilizando el protocolo estándar de limpieza de ARN (añadiendo 1 volumen de etanol antes de la unión a la columna), recomendamos utilizar el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol antes de la unión a la columna), que utiliza una mayor proporción de etanol a muestra para modificar el valor de corte de exclusión y permitir la captura de ARN más pequeños. P: ¿Puedo utilizar el kit de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar mi ARN tratado con DNasa I? R: Sí, los kits de limpieza de ARN Monarch Spin eliminarán la actividad residual de DNasa I (NEB n.° M0303) de las muestras de ARN. El tratamiento en columna con DNasa I a menudo puede resultar en actividad residual de DNasa I; por lo tanto, no recomendamos el tratamiento en columna con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin, sino el tratamiento con DNasa I en solución antes de la limpieza del ARN. P: ¿Disponen de un protocolo para separar ARN pequeños y grandes en fracciones separadas? R: Sí, el manual del kit de limpieza de ARN Monarch Spin contiene un protocolo que separa el ARN en ARN > 200 nt y < 200 nt. El protocolo también está disponible en línea. Seguir este protocolo enriquece el ARN por debajo de 200 nt en la fracción de "ARN pequeño", mientras que el ARN por encima de 200 nt se enriquece en la fracción de "ARN grande". Ningún protocolo de fraccionamiento permite una separación precisa de ARN de tamaño similar basándose únicamente en la longitud. Encontramos que el ARN entre 100-200 nt se particionará preferentemente en las diferentes fracciones según varios factores, incluyendo la estructura secundaria predicha y las interacciones con otros ARN dentro de la muestra. Las moléculas altamente estructuradas entre 100-200 nt típicamente caen en la fracción de ARN pequeño, mientras que el ARN no estructurado entre 100-200 nt cae en la fracción de ARN grande. El kit de limpieza de ARN Monarch Spin se puede utilizar para separar el ARN en fracciones de ARN grandes y pequeñas. El ARN total HeLa (5,2 μg, A1 y B1) se separó en fracciones de ARN grande (A2 y B2) y ARN pequeño (A3 y B3) después del protocolo de purificación de ARN pequeño y grande en fracciones separadas y ejecutándose en un chip Agilent Bioanalyzer® RNA Pico. Más del 96% (5 μg) del ARN de entrada se recuperó en las fracciones de ARN separadas. Las muestras 1 y 2 se diluyeron 1:20 antes del análisis. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para purificar ARN de geles de agarosa? R: Sí, el manual del kit de limpieza de ARN Monarch Spin contiene un protocolo para purificar ARN de geles de agarosa, aunque esta no es su aplicación principal. La recuperación de la extracción de ARN de agarosa oscila entre el 40 % y el 70 %, lo cual es menor que la recuperación esperada para la limpieza de ARN de reacciones enzimáticas. El protocolo también está disponible en línea. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar ARN después de una extracción con TRIzol®/cloroformo? R: Sí, el kit de limpieza de ARN Monarch Spin puede usarse para limpiar la fase acuosa de cualquier extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, eliminando la necesidad de los tediosos pasos de precipitación de ARN. El protocolo está disponible en línea o en el manual del producto. P: ¿Son compatibles los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con los reactivos Luna RT-qPCR? R: Sí. El ARN purificado con estos kits se puede usar para RT-qPCR con todos los kits Luna One-Step RT-qPCR de NEB y los productos LunaScript® RT. P: ¿Son compatibles los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con los reactivos NEBNext para la preparación de bibliotecas de ARN? R: Sí. El ARN purificado con este kit se puede usar para la preparación de bibliotecas de ARN con los reactivos NEBNext RNA Library Prep de NEB. P: ¿Son las columnas de los kits de limpieza de ARN Monarch Spin las mismas que las del kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010)? R: No, las columnas de los kits de limpieza de ARN Monarch (NEB n.° T2030, T2040 y T2050) no son las mismas que las del kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010). P: ¿Puedo comprar los tampones y las columnas Monarch® por separado? R: Las columnas de centrifugación Monarch y varios tampones y reactivos Monarch también se ofrecen por separado. P: ¿Puedo realizar un tratamiento con DNasa I en columna con las columnas para la limpieza de ARN? R: La DNasa I no se eliminará por completo si se utiliza para la digestión en columna con las columnas Monarch para la limpieza de ARN (columnas Monarch Spin S1A, S2A y S2B). Se recomienda un tratamiento con DNasa I en solución, seguido de la limpieza de ARN. P: ¿Se pueden utilizar también los kits de limpieza de ARN Monarch Spin (NEB n.° T2030, T2040 y T2050) para purificar ADN? R: Hemos utilizado con éxito los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para la purificación de ARN, ADNmc y ADNdc. Sin embargo, para una limpieza óptima del ADN, recomendamos nuestro kit de limpieza de PCR y ADN Monarch Spin (NEB n.° T1130). P: ¿Se pueden utilizar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para la extracción de ARN? R: Sí. Aunque originalmente fueron desarrollados para aplicaciones de limpieza de ARN, estos kits también pueden usarse para la extracción de ARN de células, saliva y muestras de hisopos. Cuando se usan para la extracción viral, se debe usar el reactivo de protección de ADN/ARN Monarch (vendido por separado, NEB #T2011) para la inactivación viral. Visite nuestros protocolos en línea para obtener más información: Extracción de ARN de células usando los kits de limpieza de ARN Monarch Spin Extracción de ARN de hisopos bucales/nasofaríngeos usando los kits de limpieza de ARN Monarch Spin Extracción de ARN de saliva usando los kits de limpieza de ARN Monarch Spin Automatización de la extracción de ARN viral de saliva usando el kit de limpieza de ARN Monarch Spin P: Noté que los nombres de los tampones han cambiado en los kits de limpieza de ARN. ¿Estos tampones tienen la misma formulación que antes? R: Sí, NEB está estandarizando la nomenclatura de los nombres de los tampones Monarch. Los nombres de los tampones están cambiando, pero las formulaciones de los tampones son las mismas. El tampón de unión para la limpieza de ARN Monarch® ahora se llama tampón Monarch® BX. El tampón de lavado para la limpieza de ARN Monarch® ahora se llama tampón Monarch® WX. P: Noto que estoy aplicando fuerza para encajar la columna en un tubo de recolección. ¿Debería hacerlo? ¿Qué tubos de recolección son compatibles con las columnas? R: Todos los kits Monarch® incluyen tubos de recolección compatibles para las columnas de centrifugación. Si utiliza tubos de recolección fuera de un kit determinado, utilice los tubos de recolección para centrifugación Monarch® (NEB n.° T2118). No fuerce ninguna columna en tubos de recolección no recomendados que tengan un ajuste muy ajustado para evitar dañar la columna. P: Veo residuos de sílice en mi columna Monarch. ¿Es un problema? R: No, no es un problema. La presencia de residuos o partículas de sílice en la columna de purificación de ácidos nucleicos no afecta la unión ni la pureza de los ácidos nucleicos. Nuestras columnas están diseñadas para retener las fibras de sílice, lo que ayuda a garantizar que no terminen en el eluido final. P: ¿Cómo puedo evaluar la integridad y pureza del ARN? R: La pureza de las muestras de ARN eluido se puede evaluar rápidamente revisando las relaciones de DO obtenidas durante la espectrofotometría de rutina. El ARN puro suele tener una A260/280 de 1,9 a 2,1 y una A260/230 de 2,0 a 2,2. Muchos factores pueden influir en estos valores, como el uso de una solución de referencia en blanco adecuada, el pH del tampón y contaminantes como proteínas, sales del tampón, etanol, etc. Para más información sobre este tema, consulte "Evaluación del ARN".