New England Biolabs, T2047L, Columnas de centrifugación Monarch® S2A

Categorías relacionadas Limpieza de ARN,, Extracción y purificación de ARN,, Purificación de ácidos nucleicos Preguntas frecuentes P: Noto que estoy aplicando fuerza para encajar la columna en un tubo de recolección. ¿Debería estar haciendo esto? ¿Qué tubos de recolección son compatibles con las columnas? R: Se proporcionan tubos de recolección coincidentes en todos los kits Monarch® para las columnas de centrifugación. Si usa tubos de recolección fuera de un kit determinado, utilice los tubos de recolección Monarch® Spin (NEB n.º T2118). No fuerce ninguna columna en tubos de recolección no recomendados que tengan un ajuste muy ajustado para evitar dañar la columna. P: ¿Se pueden usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para la extracción de ARN? R: Sí. Aunque originalmente se desarrollaron para aplicaciones de limpieza de ARN, estos kits también se pueden usar para la extracción de ARN de células, saliva y muestras de hisopos. Cuando se usa para la extracción viral, se debe usar el reactivo de protección de ADN/ARN Monarch (se vende por separado, NEB n.º T2011) para la inactivación viral. Visite nuestros protocolos en línea para obtener más información: Extracción de ARN de células mediante los kits de limpieza de ARN Monarch Spin Extracción de ARN de hisopos bucales/nasofaríngeos mediante los kits de limpieza de ARN Monarch Spin Extracción de ARN de saliva mediante los kits de limpieza de ARN Monarch Spin Automatización de la extracción de ARN viral de saliva mediante el kit de limpieza de ARN Monarch Spin P: ¿Qué factores afectan a mi (A260/A230) cuando se utilizan los kits de limpieza de ARN Monarch Spin? R: La guanidina y el etanol, ambos introducidos durante la preparación, pueden reducir la relación A260/A230. Seguir el protocolo, especialmente los pasos de lavado, garantizará que estos componentes se eliminen. P: ¿Puedo comprar los tampones y columnas Monarch® por separado? R: Las columnas de centrifugación Monarch y varios tampones y reactivos Monarch también se ofrecen por separado. P: Veo algunos residuos de sílice en mi columna Monarch. ¿Es esto un problema? R: No, esto no es un problema. La presencia de residuos o partículas de sílice en la columna de purificación de ácidos nucleicos no afecta la unión ni la pureza de los ácidos nucleicos. Nuestras columnas están diseñadas para retener las fibras de sílice, lo que ayuda a garantizar que no se depositen en el eluido final. P: ¿Son las columnas de los kits de limpieza de ARN Monarch Spin las mismas que las del kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010)? R: No, las columnas de los kits de limpieza de ARN Monarch (NEB n.° T2030, T2040 y T2050) no son las mismas que las del kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010). P: ¿Puedo usar el kit de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar mi ARN tratado con DNasa I? R: Sí, los kits de limpieza de ARN Monarch Spin eliminarán la actividad residual de DNasa I (NEB n.° M0303) de las muestras de ARN. El tratamiento en columna con DNasa I a menudo puede resultar en actividad residual de DNasa I; por lo tanto, no recomendamos el tratamiento en columna con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin, sino el tratamiento con DNasa I en solución antes de la limpieza del ARN. P: ¿Son compatibles los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con los reactivos NEBNext para la preparación de bibliotecas de ARN? R: Sí. El ARN purificado con este kit puede utilizarse para la preparación de bibliotecas de ARN con los reactivos NEBNext para la preparación de bibliotecas de ARN de NEB. P: ¿Cuál es la capacidad máxima de unión de la columna para la limpieza de ARN que se incluye con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin? A: Aunque en algunos casos se han observado mayores rendimientos, la matriz suministrada en cada columna es suficiente para unir las siguientes cantidades de ARN: T2030/T2037: 10 µg de ARN T2040/T2047: 50 µg de ARN T2050/T2057: 500 µg de ARN Es importante tener en cuenta que las reacciones enzimáticas introducen componentes como detergentes, colorantes, proteínas y nucleótidos, todos los cuales pueden competir por la unión a la membrana durante la limpieza y afectar la recuperación del ARN. P: ¿Puedo obtener una mejor recuperación con los kits de limpieza de ARN Monarch Spin si hago una segunda elución con mi eluyente de la primera elución? R: Se puede realizar una segunda elución para maximizar la recuperación del ARN. Esta segunda elución se puede realizar utilizando una alícuota fresca de agua libre de nucleasas o el eluyente de la primera elución para maximizar la recuperación mientras se minimiza el volumen. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para purificar ARN de geles de agarosa? R: Sí, el manual del kit de limpieza de ARN Monarch Spin contiene un protocolo para purificar ARN de geles de agarosa, aunque esta no es su aplicación principal. La recuperación de la extracción de ARN de agarosa oscila entre el 40 % y el 70 %, lo cual es menor que la recuperación esperada para la limpieza de ARN de reacciones enzimáticas. El protocolo también está disponible en línea. P: ¿Qué tamaño de ARN se puede purificar con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin? R: Con el protocolo estándar, se pueden purificar ARN ≥ 25 nt. Con una ligera modificación en el protocolo (añadiendo 2 volúmenes de etanol en lugar de 1 volumen tras la adición del tampón de unión), se puede purificar ARN > 15 nt. Recuperación de ARN pequeños con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin. Los oligonucleótidos de ARN sintetizados (1 μg en 50 μl de H₂O) de longitudes variables (15–100 nt) se purificaron con el kit Monarch Spin RNA Cleanup (NEB n.° T2040) y se eluyeron en 50 μl de agua sin nucleasas. El porcentaje de recuperación de ARN Spin se calculó a partir de la A260 resultante, medida con un Trinean DropSense™ 16. El protocolo estándar del kit Monarch Spin RNA Cleanup resulta en una recuperación y limpieza >70 % de ARN ≥ 25 nt, mientras que el uso del kit Monarch Spin RNA Cleanup con el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol en el paso 2) resulta en una recuperación y limpieza >70 % de ARN incluso más pequeños (de hasta 15 nt). Tenga en cuenta que la recuperación de ARN pequeños (< 45 nt) puede verse afectada por la secuencia, las interacciones con otros ácidos nucleicos o la estructura secundaria. La estructura secundaria afecta la recuperación de ARN pequeños (<45 nt). Los oligonucleótidos de ARN sintetizados (1 μg en 50 μl de H2O) de longitudes variables (25-40 nt) y con estructura secundaria prevista variable* se purificaron utilizando el kit de limpieza de ARN Spin Monarch (NEB n.º T2040) y se eluyeron en 50 μl de agua sin nucleasas. El porcentaje de recuperación del ARN se calculó a partir de la A260 resultante, medida con un Trinean DropSense™ 16. Los ARN pequeños (25-40 nt) con baja estructura secundaria prevista se recuperaron de forma eficiente utilizando el protocolo estándar del kit de limpieza de ARN Spin Monarch. Sin embargo, los niveles elevados de estructura secundaria reducen la recuperación de ARN pequeños (25-40 nt de longitud). La recuperación normalmente se puede aumentar a >70 % (línea naranja) utilizando el kit de limpieza de ARN Spin Monarch con el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol en el paso 2). *La estructura secundaria se predijo utilizando el servidor web RNAstructure: Reuter, JS y Mathews, DH (2010). RNAstructure: software para la predicción y el análisis de la estructura secundaria del ARN. BMC Bioinformatics. 11,129 Si se observa un bajo rendimiento de un ARN pequeño utilizando el protocolo estándar de limpieza de ARN (añadiendo 1 volumen de etanol antes de la unión a la columna), recomendamos utilizar el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol antes de la unión a la columna), que utiliza una mayor proporción de etanol a muestra para modificar el valor de corte de exclusión y permitir la captura de ARN más pequeños. P: Me gustaría limpiar aproximadamente 150 µg de ARN. ¿Sería mejor utilizar varias columnas de 50 µg (NEB n.° T2040/T2047) o una sola columna de 500 µg (NEB n.° T2050/T2057)? R: Recomendamos usar una columna de 500 µg (NEB n.° T2050/T2057) para la purificación de 150 µg de ARN en lugar de 3 o 4 columnas de 50 µg. Esperamos una recuperación de al menos el 80-90 % de 150 µg en la columna de 500 µg, lo que resultaría más rentable que usar varias columnas de menor capacidad. Sin embargo, cabe destacar que la columna de 500 µg requiere una incubación de 5 minutos con agua sin nucleasas durante la elución, por lo que el proceso de trabajo es ligeramente más largo. P: ¿Son compatibles los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con los reactivos Luna RT-qPCR? R: Sí. El ARN purificado con estos kits puede utilizarse para RT-qPCR con todos los kits Luna One-Step RT-qPCR de NEB y los productos LunaScript® RT. P: ¿Se pueden usar también los kits de limpieza de ARN Monarch Spin (NEB n.° T2030, T2040 y T2050) para purificar ADN? R: Hemos utilizado con éxito los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para la purificación de ARN, ADNmc y ADNdc. Sin embargo, para una limpieza óptima del ADN, recomendamos nuestro kit de limpieza de PCR y ADN Monarch Spin (NEB n.° T1130). P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar mi reacción de transcripción in vitro (IVT)? R: Sí, el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg) (NEB n.° T2040) es adecuado para limpiar reacciones de transcripción in vitro donde no se espera que el rendimiento supere los 50 µg. Si se espera que la producción de ARN de una transcripción in vitro supere los 50 µg, recomendamos dividir la reacción entre varias columnas Monarch Spin RNA Cleanup (50 µg) o limpiarla con el kit Monarch Spin RNA Cleanup (500 µg) (NEB n.° T2050), debido a su mayor capacidad de unión al ARN. P: ¿Puedo usar los kits Monarch Spin RNA Cleanup para limpiar el ARN después de una extracción con TRIzol®/cloroformo? R: Sí, el kit Monarch Spin RNA Cleanup puede usarse para limpiar la fase acuosa de cualquier extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, eliminando así la necesidad de los tediosos pasos de precipitación del ARN. El protocolo está disponible en línea o en el manual del producto. P: ¿Puedo realizar un tratamiento con DNasa I en columna con las columnas para la limpieza del ARN? R: La DNasa I no se eliminará por completo si se utiliza para la digestión en columna con las columnas Monarch para la limpieza de ARN (columnas Monarch Spin S1A, S2A y S2B). Se recomienda el tratamiento con DNasa I en solución, seguido de la limpieza de ARN. P: ¿Cuál es el volumen mínimo de agua sin nucleasas que se puede utilizar para la elución con las columnas Monarch Spin S1A, S2A y S2B para la limpieza de ARN? R: T2030/T2037: 6 µl; los volúmenes de elución típicos son de 6-20 µl. T2040/T2047: 20 µl; los volúmenes de elución típicos son de 20-50 µl. T2050/T2057: 50 µl; los volúmenes de elución típicos son de 50-100 µl. El uso de volúmenes de elución menores probablemente resultará en varianza debido a una humectación inconsistente de la matriz. El rendimiento puede aumentar ligeramente si se utiliza un volumen mayor, pero el ARN estará menos concentrado. *Se puede realizar una segunda elución para maximizar la recuperación del ARN. Esta segunda elución se puede realizar utilizando una alícuota fresca de agua libre de nucleasas o el eluyente de la primera elución para maximizar la recuperación y minimizar el volumen. Recuperación de ARN de los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con volúmenes de elución variables. El ARNr (10, 50 o 500 µg, respectivamente, de estándar ribosomal 16S y 23S de E. coli, Sigma) se purificó utilizando un kit de limpieza de ARN Monarch Spin (10 µg, NEB #T2030) (50 µg, NEB #T2040) (500 µg, NEB #T2050). Se utilizó agua libre de nucleasas para eluir el ARN. El porcentaje de recuperación del ARN se calculó a partir del A260 resultante, medido con un Trinean DropSense 16. Aproximadamente el 80 % del ARN se puede recuperar eficientemente en 6 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (10 µg, NEB n.° T2030), 20 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg, NEB n.° T2040) y 50 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (500 µg, NEB n.° T2050). P: ¿Es compatible el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (NEB n.° T2040) con el kit de síntesis de ARNsg de EnGen para S. pyogenes? R: Sí, los sgRNA sintetizados utilizando el kit de síntesis de sgRNA de EnGen, S. pyogenes (NEB n.° E3322) se pueden limpiar utilizando el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg, NEB n.° T2040) antes de la formación de complejos de ribonucleoproteína (RNP) y la posterior electroporación en las células.