Columnas de centrifugación Monarch® S2B y tubos T2057L de New England Biolabs

A partir del 24/9/2024, el nombre del producto cambió a Monarch Spin Columns S2B and Tubes. Categorías relacionadas Limpieza de ARN,, Extracción y purificación de ARN,, Purificación de ácidos nucleicos Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la capacidad de unión máxima de la columna para la columna de limpieza de ARN proporcionada con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin? R: Aunque en algunos casos se han observado mayores rendimientos, la matriz suministrada en cada columna es suficiente para unir las siguientes cantidades de ARN: T2030/T2037: 10 µg de ARN T2040/T2047: 50 µg de ARN T2050/T2057: 500 µg de ARN Es importante tener en cuenta que las reacciones enzimáticas introducen componentes como detergentes, colorantes, proteínas y nucleótidos, todos los cuales pueden competir por la unión a la membrana durante la limpieza y afectar la recuperación del ARN. P: ¿Cuál es el volumen mínimo de agua sin nucleasas que se puede utilizar para la elución con las columnas Monarch Spin S1A, S2A y S2B para la limpieza de ARN? R: T2030/T2037: 6 µl; los volúmenes de elución típicos son de 6 a 20 µl. T2040/T2047: 20 µl; los volúmenes de elución típicos son de 20 a 50 µl. T2050/T2057: 50 µl; los volúmenes de elución típicos son de 50 a 100 µl. El uso de volúmenes de elución menores probablemente resultará en varianza debido a una humectación inconsistente de la matriz. El rendimiento puede aumentar ligeramente si se utiliza un volumen mayor, pero el ARN estará menos concentrado. *Se puede realizar una segunda elución para maximizar la recuperación de ARN. Esta segunda elución puede realizarse con una alícuota fresca de agua libre de nucleasas o con el eluyente de la primera elución para maximizar la recuperación y minimizar el volumen. Recuperación de ARN a partir de kits de limpieza de ARN Monarch Spin con volúmenes de elución variables. El ARNr (10, 50 o 500 µg, respectivamente, de estándar ribosomal 16S y 23S de E. coli, Sigma) se purificó con un kit de limpieza de ARN Monarch Spin (10 µg, NEB n.° T2030), 50 µg, NEB n.° T2040 y 500 µg, NEB n.° T2050). Se utilizó agua libre de nucleasas para eluir el ARN. El porcentaje de recuperación del ARN se calculó a partir del A260 resultante, medido con un Trinean DropSense 16. Aproximadamente el 80 % del ARN se puede recuperar de forma eficiente en 6 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (10 µg, NEB n.º T2030), 20 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg, NEB n.º T2040) y 50 µl del kit de limpieza de ARN Monarch Spin (500 µg, NEB n.º T2050). P: ¿Puedo obtener una mejor recuperación con los kits de limpieza de ARN Monarch Spin si realizo una segunda elución con el eluyente de la primera elución? R: Se puede realizar una segunda elución para maximizar la recuperación del ARN. Esta segunda elución se puede realizar utilizando una alícuota fresca de agua sin nucleasas o el eluyente de la primera elución para maximizar la recuperación y minimizar el volumen. P: ¿Qué factores afectan mi (A260/A230) al usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin? R: La guanidina y el etanol, ambos introducidos durante la preparación, pueden reducir la proporción A260/A230. Seguir el protocolo, especialmente los pasos de lavado, garantizará la eliminación de estos componentes. P: ¿Qué tamaño de ARN se puede purificar con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin? R: Con el protocolo estándar, se pueden purificar ARN ≥ 25 nt. Con una ligera modificación en el protocolo (añadir 2 volúmenes de etanol en lugar de 1 volumen después de añadir el tampón de unión), se puede purificar ARN > 15 nt. Recuperación de ARN pequeños con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin. Los oligonucleótidos de ARN sintetizados (1 μg en 50 μl de H₂O) de longitudes variables (15–100 nt) se purificaron con el kit Monarch Spin RNA Cleanup (NEB n.° T2040) y se eluyeron en 50 μl de agua sin nucleasas. El porcentaje de recuperación de ARN Spin se calculó a partir de la A260 resultante, medida con un Trinean DropSense™ 16. El protocolo estándar del kit Monarch Spin RNA Cleanup resulta en una recuperación y limpieza >70 % de ARN ≥ 25 nt, mientras que el uso del kit Monarch Spin RNA Cleanup con el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol en el paso 2) resulta en una recuperación y limpieza >70 % de ARN incluso más pequeños (de hasta 15 nt). Tenga en cuenta que la recuperación de ARN pequeños (< 45 nt) puede verse afectada por la secuencia, las interacciones con otros ácidos nucleicos o la estructura secundaria. La estructura secundaria afecta la recuperación de ARN pequeños (<45 nt). Los oligonucleótidos de ARN sintetizados (1 μg en 50 μl de H2O) de longitudes variables (25-40 nt) y con estructura secundaria prevista variable* se purificaron utilizando el kit de limpieza de ARN Spin Monarch (NEB n.º T2040) y se eluyeron en 50 μl de agua sin nucleasas. El porcentaje de recuperación del ARN se calculó a partir de la A260 resultante, medida con un Trinean DropSense™ 16. Los ARN pequeños (25-40 nt) con baja estructura secundaria prevista se recuperaron de forma eficiente utilizando el protocolo estándar del kit de limpieza de ARN Spin Monarch. Sin embargo, los niveles elevados de estructura secundaria reducen la recuperación de ARN pequeños (25-40 nt de longitud). La recuperación normalmente se puede aumentar a >70 % (línea naranja) utilizando el kit de limpieza de ARN Spin Monarch con el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol en el paso 2). *La estructura secundaria se predijo utilizando el servidor web RNAstructure: Reuter, JS y Mathews, DH (2010). RNAstructure: software para la predicción y el análisis de la estructura secundaria del ARN. BMC Bioinformatics. 11,129 Si se observa un bajo rendimiento de un ARN pequeño utilizando el protocolo estándar de limpieza de ARN (añadiendo 1 volumen de etanol antes de la unión a la columna), recomendamos utilizar el protocolo modificado (añadiendo 2 volúmenes de etanol antes de la unión a la columna), que utiliza una mayor proporción de etanol a muestra para modificar el valor de corte de exclusión y permitir la captura de ARN más pequeños. P: ¿Puedo utilizar el kit de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar mi ARN tratado con DNasa I? R: Sí, los kits de limpieza de ARN Monarch Spin eliminarán la actividad residual de DNasa I (NEB n.° M0303) de las muestras de ARN. El tratamiento en columna con DNasa I a menudo puede resultar en actividad residual de DNasa I; por lo tanto, no recomendamos el tratamiento en columna con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin, sino el tratamiento con DNasa I en solución antes de la limpieza del ARN. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para purificar ARN de geles de agarosa? R: Sí, el manual del kit de limpieza de ARN Monarch Spin contiene un protocolo para purificar ARN de geles de agarosa, aunque esta no es su aplicación principal. La recuperación de la extracción de ARN de agarosa oscila entre el 40 % y el 70 %, lo cual es inferior a la recuperación esperada para la limpieza de ARN de reacciones enzimáticas. El protocolo también está disponible en línea. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar ARN después de una extracción con TRIzol®/cloroformo? R: Sí, el kit de limpieza de ARN Monarch Spin se puede usar para limpiar la fase acuosa de cualquier extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, eliminando así la necesidad de los tediosos pasos de precipitación del ARN. El protocolo está disponible en línea o en el manual del producto. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar mi reacción de transcripción in vitro (IVT)? R: Sí, el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg) (NEB n.° T2040) es adecuado para limpiar reacciones de transcripción in vitro donde no se espera que el rendimiento de ARN supere los 50 µg. Si se espera que el rendimiento de ARN de una transcripción in vitro supere los 50 µg, recomendamos dividir la reacción entre varias columnas de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg) o limpiarla con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (500 µg) (NEB n.° T2050), debido a su mayor capacidad de unión al ARN. P: ¿Son compatibles los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con los reactivos Luna RT-qPCR? R: Sí. El ARN purificado con estos kits se puede usar para RT-qPCR con todos los kits Luna One-Step RT-qPCR de NEB y los productos LunaScript® RT. P: ¿Son compatibles los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con los reactivos NEBNext para la preparación de bibliotecas de ARN? R: Sí. El ARN purificado con este kit se puede usar para la preparación de bibliotecas de ARN con los reactivos NEBNext RNA Library Prep de NEB. P: Mi muestra se volvió turbia después de agregar el tampón de unión de limpieza de ARN Monarch y etanol. ¿Es esto normal? R: Al limpiar grandes cantidades de ARN (>100 μg), puede producirse cierta precipitación tras la adición del tampón de unión de limpieza de ARN Monarch y etanol a la muestra. Es posible que se forme un sedimento con el ARN de interés en el lateral de la columna después del primer centrifugado. Para maximizar la recuperación de este ARN, se recomienda una segunda elución. Para maximizar la recuperación de este ARN, tenga cuidado al realizar la elución y asegúrese de que el agua libre de nucleasas se aplique directamente al pellet. Se recomienda una segunda elución para asegurar que la recuperación sea completa. P: ¿Por qué necesito incubar mi columna durante 5 minutos con tampón de elución (agua libre de nucleasas)? R: La elución de grandes cantidades de ARN (> 50 µg) se puede maximizar incubando el tampón de elución (agua libre de nucleasas) con la columna durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar. Disminuir el tiempo de incubación disminuirá la recuperación de ARN. La recuperación de ARN aumenta incubando la columna con el tampón de elución (agua libre de nucleasas) antes del centrifugado de elución. El ARNr (estándar ribosomal 16S y 23S de E. coli, Sigma) se purificó utilizando el kit de limpieza de ARN Monarch (500 µg, NEB n.º T2050). Se añadieron 100 µl de agua sin nucleasas a la columna y se incubó durante 0, 1, 3 o 5 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugar para eluir el ARN. El porcentaje de recuperación de ARN se calculó a partir de la A260 resultante, medida con un Trinean Dropsense 16. Un periodo de incubación de cinco minutos produjo el rendimiento máximo. P: ¿Son las columnas de los kits de limpieza de ARN Monarch Spin las mismas que las del kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010)? R: No, las columnas de los kits de limpieza de ARN Monarch (NEB n.° T2030, T2040 y T2050) no son las mismas que las del kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010). P: ¿Puedo comprar los tampones y las columnas Monarch® por separado? R: Las columnas de centrifugación Monarch y varios tampones y reactivos Monarch también se ofrecen por separado. P: ¿Puedo realizar un tratamiento con DNasa I en columna con las columnas para la limpieza de ARN? R: La DNasa I no se eliminará por completo si se utiliza para la digestión en columna con las columnas Monarch para la limpieza de ARN (Monarch Spin Columns S1A, S2A, S2B). Se recomienda un tratamiento con DNasa I en solución, seguido de la limpieza de ARN. P: ¿Se pueden utilizar también los kits de limpieza de ARN Monarch Spin (NEB n.° T2030, T2040 y T2050) para purificar ADN? R: Hemos utilizado con éxito los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para la purificación de ARN, ADNmc y ADNdc. Sin embargo, para una limpieza óptima del ADN, recomendamos nuestro kit de limpieza de PCR y ADN Monarch Spin (NEB n.° T1130). P: Me gustaría limpiar aproximadamente 150 µg de ARN. ¿Sería mejor usar varias columnas de 50 µg (NEB n.° T2040/T2047) o una sola columna de 500 µg (NEB n.° T2050/T2057)? R: Recomendamos usar una columna de 500 µg (NEB n.° T2050/T2057) para la purificación de 150 µg de ARN en lugar de 3 o 4 columnas de 50 µg. Esperamos una recuperación de al menos el 80-90 % de 150 µg en la columna de 500 µg y sería más rentable que usar varias columnas de menor capacidad. Sin embargo, cabe destacar que la columna de 500 µg requiere una incubación de 5 minutos con agua sin nucleasas durante la elución, por lo que el proceso de trabajo es ligeramente más largo. P: Noto que estoy aplicando fuerza para encajar la columna en un tubo de recolección. ¿Debería hacerlo? ¿Qué tubos de recolección son compatibles con las columnas? R: Todos los kits Monarch® incluyen tubos de recolección compatibles para las columnas de centrifugación. Si utiliza tubos de recolección fuera de un kit determinado, utilice los tubos de recolección Monarch® Spin (NEB n.° T2118). No fuerce ninguna columna en tubos de recolección no recomendados que tengan un ajuste muy ajustado para evitar dañar la columna. P: Veo residuos de sílice en mi columna Monarch. ¿Es un problema? R: No, no es un problema. La presencia de residuos o partículas de sílice en la columna de purificación de ácidos nucleicos no afecta la unión ni la pureza de los ácidos nucleicos. Nuestras columnas están diseñadas para retener fibras de sílice, lo que ayuda a garantizar que no terminen en el eluido final. P: ¿Cómo puedo evaluar la integridad y la pureza del ARN? R: La pureza de las muestras de ARN eluidas se puede evaluar rápidamente revisando las relaciones de DO obtenidas durante la espectrofotometría de rutina. El ARN puro suele tener una A260/280 de 1,9 a 2,1 y una A260/230 de 2,0 a 2,2. Muchos factores pueden influir en estos valores, como el uso de una solución de referencia en blanco adecuada, el pH del tampón y contaminantes como proteínas, sales del tampón, etanol, etc. Para más información sobre este tema, consulte Evaluación del ARN.