New England Biolabs, T3005L, Perlas de captura de ADN Monarch®

Categorías relacionadas Extracción de ADN de alto peso molecular, Extracción y purificación de ADN genómico, Purificación de ácidos nucleicos Preguntas frecuentes P: Se me cayeron algunas de mis perlas de vidrio. ¿Puedo limpiarlas? ¿Suministran perlas adicionales? R: NEB proporciona un excedente de perlas para dar cabida a los usuarios que pueden dejarlas caer. En los kits de 5 preparaciones, proporcionamos 2 perlas adicionales, y en los kits de 50 preparaciones, proporcionamos entre 5 y 7 perlas adicionales. Las perlas de captura de ADN Monarch también están disponibles para su compra por separado (NEB n.º T3005). Además, cualquier perla que se caiga se puede lavar con una solución de detergente (p. ej., SDS al 2 % o RNaseZap), enjuagar con agua y con etanol al 70 %, secar y luego usar. P: ¿Hay algo especial acerca de las perlas de captura de ADN Monarch o puedo usar cualquier perla de vidrio? R: Las perlas de captura de ADN Monarch son perlas de vidrio de borosilicato especializadas, optimizadas para la extracción de ADN de alto peso molecular en el flujo de trabajo de extracción Monarch. Aunque otras perlas de vidrio pueden purificar con éxito ADN de alto peso molecular (HMW), las perlas de captura Monarch ofrecen un rendimiento óptimo en aplicaciones posteriores como la secuenciación con nanoporos. No podemos garantizar un rendimiento equivalente utilizando otras perlas de vidrio además de las proporcionadas. P: ¿Cómo sé si mi ADN de alto peso molecular se ha adherido a las perlas de vidrio de los kits de extracción de ADN de alto peso molecular Monarch? R: Cuando las muestras contienen más de 10 µg de ADN de alto peso molecular (HMW), lo cual es común al trabajar con cantidades de entrada estándar, la unión del ADN a las perlas es visible y se observará como una capa opaca y turbia que las cubre. Las perlas siempre se mantendrán unidas después de que esta cantidad de ADN se haya unido a ellas. Cuando las inversiones se realizan manualmente utilizando cantidades de entrada estándar, se puede observar y seguir el proceso de unión. Después de 5 inversiones, el ADN, con su aspecto turbio, se hace visible y, en las siguientes 10 inversiones, se conecta a las perlas y comienza a envolverse alrededor de ellas. En este punto, la solución permanece viscosa. Una vez que el ADN esté completamente enrollado alrededor de las perlas durante las 10-15 inversiones restantes, la solución dejará de ser viscosa. Las muestras de "entrada baja" suelen producir entre 1 y 10 µg de ADN de alto peso molecular, y la unión del ADN puede ser más difícil de seguir. Si solo hay entre 1 y 5 µg de ADN, probablemente no será posible ver la unión del ADN a las perlas; las perlas parecerán moverse libre e independientemente en la solución. Cuando hay entre 5 y 10 µg de ADN, es difícil ver la unión del ADN a las perlas, pero el ADN unido a menudo hará que las perlas se adhieran entre sí. P: ¿Hay algún beneficio en añadir una selección de tamaño (p. ej., Eliminador de lectura corta Circulomics®) después de la extracción? R: Según la experiencia de NEB, no suele ser necesario un paso de selección de tamaño antes de la secuenciación por nanoporos basada en ligadura. Al trabajar con materiales de partida frescos y de alta calidad, las longitudes de lectura N50 son altas (35-55 kb, dependiendo de la muestra) y una selección de tamaño adicional del ADN HMW proporcionará solo una mejora marginal en la longitud de lectura. Sin embargo, al trabajar con materiales de partida de menor calidad, por ejemplo, aquellos que se han almacenado de forma subóptima, o al trabajar con muestras que son muy difíciles de lisar (p. ej., cola de ratón), el ADN resultante contendrá una mayor porción de fragmentos cortos. En estos casos, puede ser útil realizar un paso de enriquecimiento para obtener mejores resultados de secuenciación; cualquier producto de selección de tamaño (p. ej., Short Read Eliminator) se puede utilizar con el ADN aislado con los kits de extracción de ADN Monarch HMW. P: ¿Se puede utilizar el kit de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de levaduras y/o hongos? R: Hemos validado nuestro kit para procesar muestras de levaduras y hemos publicado un protocolo basado en el trabajo con muestras de S. cerevisiae. No hemos probado internamente el kit en hongos filamentosos. Sin embargo, basándonos en nuestro trabajo en el desarrollo de nuestro kit de sílice (NEB #T3010), que utiliza una química de lisis similar, descubrimos que nuestra química puede funcionar para ciertos hongos cuando la muestra se congela en nitrógeno líquido y se muele hasta obtener un polvo fino con un mortero. Para los hongos, se debe utilizar material de partida seco. Sin embargo, este enfoque tendría que probarse para su especie específica. P: ¿Se pueden utilizar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar la capa leucocítica humana? R: Sí, el kit de extracción de ADN Monarch HMW para células y sangre (NEB #T3050) se puede utilizar para procesar la capa leucocítica. Al trabajar con la capa leucocítica, que es una solución concentrada de PBMC, se deben utilizar cantidades de entrada menores que al trabajar con sangre. El recuento celular total no debe ser superior a 1 x 10⁻ células para el protocolo estándar (agitación a 2000 rpm) ni superior a 5 x 10⁻ células cuando se necesita ADN UHMW (baja agitación). La capa leucocítica obtenida de los bancos de sangre contiene hasta 1 x 109 PBMC por 30-80 ml, lo que equivale aproximadamente a 1 x 107 -3 x 107 células/ml. Sugerimos comenzar con 100-300 μl de esta solución, agregar PBS a un volumen total de 500 μl y pasar al procedimiento de lisis de eritrocitos como si fuera una muestra de sangre de 500 μl. P: ¿Se pueden usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras ambientales o fecales para estudios metagenómicos? R: No recomendamos nuestro kit para procesar muestras ambientales como el suelo ni para procesar muestras fecales. Estas muestras tienen dos desafíos principales: ambas tienen una carga de nucleasa muy alta y contienen inhibidores que son muy difíciles de eliminar (ácido húmico para el suelo, ácidos biliares para muestras fecales). La carga de nucleasas produce una degradación significativa del ADN, lo cual no es adecuado para el aislamiento de ADN de alto peso molecular (HMW), y los inhibidores presentes en dichas muestras no se eliminarán eficazmente con la química actual del kit. P: ¿Se pueden utilizar los kits de extracción de ADN de alto peso molecular Monarch para aislar ADN de BAC? R: No hemos realizado pruebas, pero esperamos que funcione, ya que las construcciones de BAC tienen un tamaño óptimo para la unión a las microesferas. Sin embargo, las BAC suelen ser construcciones con un número de copias muy bajo, y se necesitará una cantidad significativa de cultivo para acumular suficiente ADN de BAC para la unión a las microesferas (> 5 μg). Esto aumentará el volumen de tampón necesario para la lisis alcalina. En total, el volumen de los tres tampones de lisis alcalina no debe superar los 1100 μl para que el ADN pueda seguir unido a las microesferas en un tubo de reacción de 2 ml. Puede que se requiera cierta optimización, pero debería ser posible conectar la química de la lisis alcalina con la unión a las microesferas y la purificación de los protocolos Monarch. P: ¿Funciona el flujo de trabajo de extracción de ADN de alto peso molecular (HMW) de Monarch con células individuales? R: Lamentablemente, este flujo de trabajo no es compatible con células individuales. El sistema requiere una masa crítica de ADN (≥ 1 μg en ~100 μl) para una unión eficaz a las microesferas. P: ¿Se pueden utilizar los kits de extracción de ADN de alto peso molecular (HMW) de Monarch para procesar nematodos? R: Sí. Hemos aislado con éxito ADN de alto peso molecular (HMW) de C. elegans con el kit de extracción de ADN de alto peso molecular (HMW) de Monarch para tejido (NEB n.° T3060) utilizando el protocolo estándar para muestras de tejido (se procesaron gusanos de dos placas). Recomendamos utilizar un homogeneizador de rotor-estator para la homogeneización de las muestras y obtener los mejores resultados. P: Tengo problemas para disolver mi ADN de alto peso molecular después del aislamiento. ¿Tienen algún consejo para aumentar la solubilidad? R: El ADN de alto peso molecular (HMW) es notoriamente difícil de disolver. Cuando las muestras de ADN están muy concentradas o contienen ADN de peso molecular ultraalto, disolverlo puede ser aún más difícil. En general, cuanto más compactado esté el ADN, más difícil será disolverlo. Las perlas de vidrio empleadas en los kits de extracción de ADN Monarch HMW proporcionan una amplia superficie para que el ADN se enrolle, lo que generalmente mantiene el ADN en una conformación abierta, facilitando su disolución. Sin embargo, la solubilidad puede ser un problema. A continuación, se ofrecen algunos consejos para maximizar la solubilidad del ADN al trabajar con los kits de extracción de ADN Monarch HMW: Intente minimizar el tiempo que el ADN permanece unido a las perlas sin líquido. Tras retirar el líquido de las perlas, añada el siguiente tampón sin demora. Cuanto más tiempo se seque el ADN en las perlas, más compacto estará y más difícil será su disolución posterior. Al unir el ADN a las perlas, no invierta la muestra más tiempo del recomendado. Cuanto más tiempo pase el ADN enrollado alrededor de las perlas, más compactado estará y más difícil será su disolución posterior. Revise nuestra guía de uso, Homogeneización de muestras de ADN de alto peso molecular (ADN HMW) después de la elución para obtener más consejos sobre la homogeneización de ADN HMW después de la elución.