New England Biolabs, T3016L, tampón de elución de ADNg Monarch®

Categorías relacionadas: Extracción y purificación de ADN genómico, Aplicaciones de purificación de ácidos nucleicos, Preguntas frecuentes sobre la purificación de ácidos nucleicos. P: ¿Cuál es la composición de cada tampón incluido en el kit de extracción de ADN genómico Monarch® Spin? R: La composición de los tampones es exclusiva. Sin embargo, podemos compartir la siguiente información: Monarch® gDNA Tissue Lysis Buffer.....................Tampón de lisis a base de detergente Monarch® gDNA Cell Lysis Buffer........................Tampón de lisis a base de clorhidrato de guanidinio Monarch® gDNA Blood Lysis Buffer..................Tampón de lisis a base de clorhidrato de guanidinio Monarch® gDNA Binding Buffer...........................Tampón a base de tiocianato de guanidinio Monarch® gDNA Wash Buffer..................................Tampón de lavado a base de etanol Monarch® gDNA Elution Buffer............................10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1 mM EDTA P: ¿Cuál es el volumen mínimo de elución que se puede utilizar con las columnas del kit de extracción de gDNA Monarch® Spin? R: El volumen mínimo de elución es de 35 µl. Para una recuperación máxima, se recomiendan 100 µl. Volúmenes de elución más pequeños darán lugar a muestras más concentradas, pero también a un menor rendimiento. Normalmente, cuando se utilizan 35 µl para la elución, los rendimientos son aproximadamente un 20% menores que cuando se utilizan 100 µl. El uso de volúmenes de elución inferiores a 35 µl dará como resultado una humectación inconsistente de la matriz de sílice y una recuperación significativamente reducida. Recuperación de ADN genómico utilizando varios volúmenes de elución en el kit de extracción de gDNA Monarch Spin El rango óptimo de volumen de elución para la elución es de 35 a 100 µl. Se preparó un pool de lisado utilizando muestras de hígado de rata estabilizadas con 10 mg de RNAlater® y siguiendo el protocolo de tejido Monarch. Los volúmenes de elución utilizados en muestras triplicadas fueron 25, 30, 35, 40, 50, 75 y 100 µl. El rendimiento promedio obtenido con un volumen de elución de 100 µl fue de 19,1 µg, que se consideró un rendimiento del 100%. Usando 35 µl para eluir, el rendimiento promedio fue del 81,6%; 25 µl y 20 µl produjeron un 74% y un 70,6%, respectivamente. Para volúmenes ≥35 µl, el volumen recuperado después de la elución fue ~5 µl menor que el volumen de elución añadido y para <30 µl el volumen recuperado fue ~10 µl menor. Las pruebas realizadas con otros materiales de partida mostraron resultados similares, con una reducción del 20-25% en el rendimiento general cuando los volúmenes de elución se redujeron de 100 a 35 µl. Para más información, consulte “Consideraciones para la elución y el almacenamiento” en el manual del producto. P: ¿Qué tan importante es precalentar el tampón de elución a 60 °C? ¿56 °C estaría bien? R: El precalentamiento del tampón de elución es esencial para la recuperación máxima con el kit de extracción de ADNg Monarch® Spin. Si resulta más conveniente, se puede usar una temperatura de 56 °C, pero puede resultar en una reducción muy leve del rendimiento. También se puede usar un tampón de elución a temperatura ambiente, pero resultará en una reducción del 20-30 % del rendimiento y puede requerir una segunda elución. Además, a temperatura ambiente, los fragmentos grandes de ADNg eluirán con menor eficiencia, por lo que el ADNg eluido tendrá un tamaño promedio menor. Para obtener más información, consulte “Consideraciones para la elución y el almacenamiento” en el manual del producto. P: ¿Puedo obtener una mejor recuperación con el kit de extracción de ADNg Monarch® Spin si hago una segunda elución con mi eluyente de la primera elución? R: El protocolo Monarch para la purificación de ADNg se ha optimizado para lograr la máxima velocidad y comodidad. El paso de elución con tampón de elución precalentado permite una recuperación máxima en un solo paso de elución. Sin embargo, se puede realizar un segundo paso de elución para maximizar la recuperación. Esta segunda elución se puede realizar utilizando una alícuota nueva de Monarch gDNA Elution Buffer o el eluyente de la primera elución, para minimizar la dilución del ADN. Se puede lograr un aumento del 10% en el rendimiento total. Para obtener más información, consulte “Consideraciones para la elución y el almacenamiento” en el manual del producto. P: ¿Puedo utilizar un tampón de elución diferente al suministrado con el Monarch® Spin gDNA Extraction Kit (NEB #T3010)? R: El tampón de elución suministrado con el kit es 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1 mM EDTA. Este tampón es óptimo para el almacenamiento a largo plazo de gDNA. Se puede utilizar cualquier tampón bajo en sal para la elución, como 10 mM Tris-HCl pH 8,5, tampón TE o agua libre de nucleasas. Precalentar el tampón de elución a 60 °C garantiza una elución rápida y eficiente del gDNA. Para obtener más información, consulte “Consideraciones para la elución y el almacenamiento” en el manual del producto. P: ¿Qué tamaño de ADNg se puede purificar con el kit de extracción de ADNg Monarch® Spin? R: Suponiendo que se ha utilizado material de partida de alta calidad, el tamaño de pico del ADNg aislado con este kit oscila entre 50 y 60 kb. Los números de integridad del ADN (DIN) típicos para el ADNg aislado de sangre, células o tejidos son de alrededor de 9,0. El protocolo de purificación de ADNg Monarch está optimizado para el aislamiento de ADNg de mayor tamaño que el aislado por otros kits comerciales. Por ejemplo, incluye la elución con tampón precalentado que mejora la elución de fragmentos de ADN más grandes. Sin embargo, algunos materiales de partida, como los hisopos bucales o la saliva, contienen una proporción significativa de células muertas. En esas células, los mecanismos apoptóticos han activado nucleasas que digieren el ADNg en fragmentos más cortos. El tamaño de pico del ADNg aislado de dichas muestras suele estar en el rango de 20 a 40 kb. P: ¿Cómo puedo evaluar la integridad y pureza del ADNg? R: La pureza de las muestras de ADNg eluidas se evalúa revisando las relaciones de DO obtenidas durante la espectrofotometría de rutina. El ADNg puro suele tener una A260/280 de 1,8-1,9 y una A260/230 de 1,8-2,5. La integridad del ADNg se evalúa cargando aproximadamente 100 ng por muestra en un gel de agarosa al 0,75 % y comparando la distribución de tamaño con un marcador adecuado, como el ADN lambda, ya sea como ADN de longitud completa (NEB n.° N3011) o digerido con HindIII (NEB n.° N3012). Normalmente, en el caso del ADNg intacto, la mayor parte de la señal del ADNg será mayor que la banda superior de la digestión con HindIII. Como alternativa, las muestras de ADNg pueden analizarse en una Agilent TapeStation® utilizando una cinta Genomic DNA ScreenTape. Este sistema proporcionará información sobre el tamaño de pico del ADNg y su integridad general mediante el DIN (Número de Integridad del ADN). Un tamaño de pico alto (>50 kb) y un DIN >8,5 indican que el ADN es de alta calidad. Para obtener más información sobre la evaluación de la pureza de los ácidos nucleicos, descargue nuestra nota de aplicación, Guía práctica para el análisis de la concentración y pureza de ácidos nucleicos con espectrofotómetros de microvolumen. P: ¿Puedo omitir el paso de centrifugación de unión a baja velocidad para ahorrar tiempo? R: Puede omitir este paso si lo desea y aun así obtendrá buenos resultados. Sin embargo, los resultados serán inconsistentes y, dependiendo del material de partida, el rendimiento puede reducirse entre un 5 y un 30 %. La unión a baja velocidad es especialmente importante para una recuperación óptima al procesar muestras de tejido con altas cantidades de ADN y al realizar el Protocolo de Limpieza de ADN Genómico. P: ¿Cómo debo almacenar las muestras de ADNg purificadas? R: Las muestras de ADNg purificadas se pueden almacenar a 4 °C. Sin embargo, para un almacenamiento prolongado, recomendamos almacenarlas a -20 °C. El kit de extracción de ADNg Monarch® Spin (Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, EDTA 0,1 mM) que se suministra con el kit de purificación de ADN genómico Monarch proporciona mayor seguridad para el almacenamiento a largo plazo de muestras de ADNg. P: Al trabajar con otros kits comerciales basados ​​en columnas de sílice, ocasionalmente observo un precipitado blanco en el eluido. ¿Qué es esto? R: Algunas matrices de sílice liberan fibras de sílice durante la elución. Aunque las fibras de sílice generalmente no afectan a la mayoría de las aplicaciones posteriores, sí influyen en las mediciones de DO y deben eliminarse mediante centrifugación si se necesitan valores espectrofotométricos fiables. Las columnas de purificación de ADN genómico Monarch contienen una membrana de retención que impide el paso de las fibras de sílice, eliminando así la necesidad de realizar una centrifugación adicional antes de un análisis espectrofotométrico preciso. P: ¿El ADNg purificado con Monarch es compatible con plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS) como PacBio y nanopore? R: Sí. El ADNg purificado con este kit se puede utilizar para diversas aplicaciones en estas plataformas de secuenciación. Suponiendo que se haya utilizado material de entrada de alta calidad, se pueden lograr rutinariamente longitudes de lectura de hasta 50 kb utilizando ADNg purificado por Monarch a partir de diferentes materiales de partida. La calidad del ADN purificado por Monarch es superior al ADN purificado con SDS Proteinasa K comúnmente utilizado para la secuenciación de Nanopore. 2 µg de ADN genómico de E. coli extraído utilizando Monarch o siguiendo un protocolo tradicional de isopropanol con SDS Proteinasa K se fragmentó enzimáticamente con tiempos de incubación idénticos y se utilizó como ADN de entrada para la preparación de la biblioteca MinION. Se siguió el protocolo del kit 1D de Oxford Nanopore Technology para preparar las bibliotecas. Ambas bibliotecas se ejecutaron en el MinION, los datos se recopilaron durante 48 horas y se llamó a la base utilizando Albacore. El ADN purificado por Monarch tuvo un mejor rendimiento en todas las métricas de secuenciación, incluyendo longitud de lectura, calidad de lectura y datos de secuenciación totales recopilados. Los gráficos ilustran que los datos purificados por Monarch proporcionan un mayor porcentaje de datos de secuenciación de alta calidad que el ADN purificado con SDS Proteinasa K. Monarch proporciona material de partida de excelente calidad para la secuenciación de Pacific Biosciences (PacBio). Se aisló gDNA bacteriano de 5x109 células E. coli ER2683 con el plásmido pACYC184 siguiendo el protocolo rápido Monarch para bacterias Gram. Se cortaron 10 µg de gDNA purificado por Monarch con un Covaris® g-TUBE, buscando un tamaño de fragmento de 10 kb. Se utilizaron 5 µg de ADN cortado para la preparación de la biblioteca de acuerdo con el protocolo estándar de PacBio (sin selección de tamaño). Las muestras se secuenciaron en un secuenciador RSII de Pacific Biosciences, utilizando la química P6/C4, se cargaron como una biblioteca SMRTbell de 10 pM y los datos se recopilaron en una película de 5 horas. Bases totales (rendimiento): 1208 Mb, longitud de lectura promedio de polimerasa: 16.046, calidad de lectura de polimerasa: 0,85. Promedio de lecturas de longitud de inserto: 6060, Lecturas de calidad de inserto: 0,89, Lectura más larga de inserto: 43 680. A. Las longitudes de inserto indican que la mayoría de las lecturas se encontraban en el rango de tamaño de inserto deseado. B. Las longitudes de lectura de la polimerasa indican que el ADN purificado era de alta calidad, lo que permitió que la enzima leyera el inserto varias veces dentro del constructo SMRTbell. C. Los datos de evaluación de carga ilustran además que el ADN purificado es de alta calidad.