Kit de extracción de ADN Monarch® HMW para células y sangre, T3050L, de New England Biolabs

Categorías relacionadas: Extracción de ADN de alto peso molecular, Purificación de ácidos nucleicos. Preguntas frecuentes. P: ¿Cómo afecta el exceso de proteína residual en las preparaciones de sangre y tejido al proceso de purificación? R: Si hay exceso de proteína en el lisado antes de añadir isopropanol para la precipitación, la proteína contaminante inhibe la correcta unión del ADN a las microesferas. El exceso de proteína en el lisado hace que el ADN precipitado flote en él y no le permite unirse eficazmente a las microesferas. Además, las microesferas de vidrio tienden a atascarse en el fondo de los tubos de 2 ml. Por lo tanto, es fundamental eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante con hemoglobina del sedimento de eritrocitos durante la preparación de sangre; no dejar más de 20 μl. Lo mismo ocurre con las preparaciones de tejido; exceder las cantidades máximas de entrada también provocará un exceso de proteína en el lisado y el ADN no se unirá eficazmente a las microesferas. P: ¿Qué sistema de medición es el más adecuado para evaluar la concentración de ADN de alto peso molecular? R: Según nuestra experiencia, y contrariamente a la creencia popular, medir la concentración de ADN de alto peso molecular (APM) con Qubit® no es el método más preciso. Las mediciones de DO proporcionan valores de concentración más precisos, pero debido a la viscosidad de las muestras de ADN de alto peso molecular (APM), se requieren varias réplicas. Las lecturas de Qubit suelen subestimar la cantidad de ADN de alto peso molecular; para el ADN genómico aislado con columnas de centrifugación de sílice (normalmente de 20 a 80 kb), Qubit proporciona lecturas de concentración de ADN entre un 10 % y un 15 % inferiores a las obtenidas con espectrofotómetro. La capacidad del colorante intercalante para teñir el ADN disminuye al aumentar la longitud del fragmento de ADN, lo que resulta en una diferencia aún mayor entre los valores de Qubit y de DO al trabajar con ADN de alto peso molecular. Las diferencias pueden ser de hasta un 35 %, o incluso superiores en algunos casos, lo que resulta en una subestimación significativa de la concentración de ADN. P: Se me cayeron algunas microesferas de vidrio. ¿Puedo limpiarlas? ¿Suministran más? R: NEB proporciona un excedente de microesferas para los usuarios que puedan dejarlas caer. En los kits de 5 preparaciones, proporcionamos 2 microesferas adicionales, y en los kits de 50 preparaciones, proporcionamos entre 5 y 7 microesferas adicionales. Las microesferas de captura de ADN Monarch también se pueden comprar por separado (NEB n.° T3005). Además, las microesferas que se caigan se pueden lavar con una solución de detergente (p. ej., SDS al 2 % o RNaseZap), enjuagar con agua y con etanol al 70 %, secar y usar. P: ¿Tienen alguna característica especial las microesferas de captura de ADN Monarch? ¿Puedo usar cualquier microesfera de vidrio? R: Las microesferas de captura de ADN Monarch son microesferas de vidrio de borosilicato especializadas, optimizadas para la extracción de ADN de alto peso molecular (APM) en el flujo de trabajo de extracción Monarch. Si bien otras microesferas de vidrio pueden purificar ADN de alto peso molecular con éxito, las microesferas de captura Monarch ofrecen un rendimiento óptimo en aplicaciones posteriores como la secuenciación con nanoporos. No podemos garantizar un rendimiento equivalente utilizando otras microesferas de vidrio además de las proporcionadas. P: ¿Son los kits de extracción de ADN de alto peso molecular Monarch compatibles con las muestras almacenadas en el reactivo de protección de ADN/ARN Monarch, RNAlater, DNA/RNA Shield, etc.? R: Sí. Para RNAlater®, basta con eliminar completamente la solución estabilizadora antes del procesamiento. Posteriormente, se pueden seguir los protocolos estándar. Si se trabaja con el reactivo de protección de ADN/ARN Monarch (NEB n.° T2011) o DNA/RNA Shield® de Zymo, el reactivo debe utilizarse como dilución 1X para la lisis, en lugar del tampón de lisis incluido en el kit. Sin embargo, en general, los resultados obtenidos con materiales frescos y congelados son superiores a los de las muestras estabilizadas en cuanto a rendimiento, pureza y longitud de fragmento. P: ¿Cómo sé si mi ADN de alto peso molecular (HMW) se ha unido a las microesferas de vidrio en los kits de extracción de ADN de alto peso molecular de Monarch? R: Cuando las muestras contienen >10 µg de ADN de alto peso molecular, lo cual es habitual al trabajar con cantidades de "Entrada estándar", la unión del ADN a las microesferas es visible y se verá como una capa turbia y opaca que las cubre. Las microesferas siempre se unirán entre sí después de que esta cantidad de ADN se haya unido a ellas. Cuando las inversiones se realizan manualmente utilizando cantidades de 'Entrada estándar', el proceso de unión se puede ver y seguir. Después de 5 inversiones, el ADN en forma de nube se hace visible, y en las siguientes 10 inversiones, se conecta a las perlas y comienza a enrollarse alrededor de ellas. En este punto, la solución permanece viscosa. Una vez que el ADN está completamente enrollado alrededor de las perlas durante las 10-15 inversiones restantes, la solución ya no será viscosa. Las muestras de 'Entrada baja' generalmente producen entre 1 y 10 µg de ADN de alto peso molecular y la unión del ADN puede ser más difícil de seguir. Si solo hay 1-5 µg de ADN presentes, probablemente no será posible ver la unión del ADN a las perlas; las perlas parecerán moverse libre e independientemente en la solución. Cuando hay entre 5 y 10 µg de ADN, es difícil ver la unión del ADN a las perlas, pero el ADN unido a menudo hará que las perlas se adhieran entre sí. P: ¿Existe algún beneficio al añadir un método de selección de tamaño (p. ej., el Eliminador de Lecturas Cortas Circulomics®) después de la extracción? R: Según la experiencia de NEB, no suele ser necesario un paso de selección de tamaño antes de la secuenciación por nanoporos basada en ligadura. Al trabajar con materiales de partida frescos y de alta calidad, las longitudes de lectura N50 son altas (35-55 kb, según la muestra) y una selección de tamaño adicional del ADN de alto peso molecular solo proporcionará una mejora marginal en la longitud de lectura. Sin embargo, al trabajar con materiales de partida de menor calidad, por ejemplo, aquellos con un almacenamiento deficiente, o al trabajar con muestras muy difíciles de lisar (p. ej., cola de ratón), el ADN resultante contendrá una mayor proporción de fragmentos cortos. En estos casos, puede ser útil realizar un paso de enriquecimiento para obtener mejores resultados de secuenciación; cualquier producto de selección de tamaño (p. ej., el Eliminador de Lecturas Cortas) se puede utilizar con el ADN aislado con los kits de extracción de ADN Monarch de alto peso molecular. P: ¿Puedo seguir usando los kits de extracción de ADN Monarch HMW si no tengo un mezclador térmico? R: Si el objetivo es obtener ADN de tamaño máximo, no es necesario agitar durante la lisis en el mezclador térmico. Sin embargo, la digestión con proteinasa K debe realizarse a 56 °C. Para asegurar una lisis adecuada, invierta la muestra lentamente varias veces durante la incubación con proteinasa K. Tenga en cuenta que las muestras lisadas sin agitación serán muy viscosas y difíciles de manipular. Si el objetivo es ADN ajustado a 50 kb-250 kb (óptimo para la secuenciación por nanoporos basada en ligadura), recomendamos encarecidamente trabajar con un mezclador térmico (p. ej., Eppendorf® ThermoMixer® C). Esto resultará en una cizalladura controlada hasta el rango de tamaño de fragmento óptimo. Si no se puede acceder a un mezclador térmico, la mejor alternativa para la agitación en el mezclador térmico es agitar con vórtex pulsado durante un minuto a la máxima velocidad posible después de la incubación de la lisis. Para muestras de tejido, agite brevemente la muestra aproximadamente cada minuto al inicio de la incubación de lisis, hasta que no queden restos de tejido. Luego, agite de nuevo durante un minuto después de la incubación. P: ¿Puedo usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de plantas? R: No recomendamos este kit para la extracción de ADN de plantas. Los polisacáridos de los lisados ​​vegetales no se eliminan eficazmente con el tampón de lisis de ADNg HMW incluido en el kit de extracción de ADN Monarch HMW para tejido (NEB n.° T3060). La presencia de polisacáridos residuales impide la unión del ADN a las perlas de vidrio. Si dispone de su propio sistema de lisis que pueda utilizarse junto con nuestro flujo de trabajo, le recomendamos que lo pruebe. Nuestro trabajo inicial destacó la importancia de comenzar con al menos 50 mg de tejido vegetal, ya que la eficiencia de unión a las perlas de vidrio requiere una masa crítica de ADN. Usar cantidades de entrada menores no proporcionará suficiente ADN para permitir la unión a las perlas. Si se realiza una preparación de núcleos a partir de muestras de plantas, elija el kit de extracción de ADN Monarch HMW para células y sangre (NEB n.° T3050) para procesar los núcleos de las plantas (NEB no ha validado este método, pero invita a los usuarios a probarlo). Si los núcleos de las plantas están presentes en un tampón específico, utilice este tampón en lugar del tampón de preparación de núcleos. Como alternativa, sedimente los núcleos y resuspéndalos en el tampón de preparación de núcleos y siga el protocolo a partir de ahí. Le animamos a compartir sus comentarios sobre las pruebas de nuestra tecnología con muestras de plantas enviándonos un correo electrónico a info@neb.com. P: ¿Puedo usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de insectos? R: Hemos aislado con éxito ADN HMW de A. aegypti (15 mg) utilizando el protocolo de tejido estándar. Aunque no hemos validado internamente ningún otro insecto en este momento, otros han procesado con éxito moscas, polillas, artrópodos (escorpión) y algunos nematodos. Las siguientes consideraciones pueden ser útiles: Trabaje con muestras frescas si es posible; la congelación y descongelación puede activar la actividad de las nucleasas Cuando trabaje con insectos más grandes, recomendamos retirar el material intestinal (que es rico en nucleasas) antes de la homogeneización Es esencial una homogeneización completa con un mortero o un homogeneizador de rotor y estator, y es importante agregar rápidamente el tampón de lisis (que elimina las nucleasas) después de la homogeneización P: ¿Se puede usar el kit de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de levaduras o hongos? R: Hemos validado nuestro kit para procesar muestras de levaduras y hemos publicado un protocolo basado en el trabajo con muestras de S. cerevisiae. No hemos probado internamente el kit en hongos filamentosos. Sin embargo, con base en nuestro trabajo en el desarrollo de nuestro kit de sílice (NEB #T3010), que usa una química de lisis similar, descubrimos que nuestra química puede funcionar para ciertos hongos cuando la muestra se congela en nitrógeno líquido y se muele hasta obtener un polvo fino usando un mortero. Para los hongos, se debe usar material de partida seco. Sin embargo, este enfoque tendría que probarse para su especie específica. P: ¿Se pueden usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar la capa leucocítica humana? R: Sí, el kit de extracción de ADN Monarch HMW para células y sangre (NEB n.° T3050) se puede usar para procesar la capa leucocítica. Al trabajar con la capa leucocítica, que es una solución concentrada de PBMC, se deben usar cantidades de entrada menores que al trabajar con sangre. El recuento celular total no debe ser superior a 1 x 10⁻¹ células para el protocolo estándar (agitación a 2000 rpm) ni superior a 5 x 10⁻¹ células cuando se necesita ADN UHMW (baja agitación). La capa leucocítica obtenida de bancos de sangre contiene hasta 1 x 10⁻¹ PBMC por 30-80 ml, lo que equivale aproximadamente a 1 x 10⁻¹ - 3 x 10⁻¹ células/ml. Sugerimos comenzar con 100-300 μl de esta solución, agregar PBS hasta un volumen total de 500 μl y pasar al procedimiento de lisis de eritrocitos como si fuera una muestra de sangre de 500 μl. P: ¿Se pueden usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de enjuague bucal? R: No lo hemos probado, pero esperaríamos que funcione con el kit de extracción de ADN Monarch HMW para células y sangre (NEB #T3050). La población celular en una muestra de enjuague bucal generalmente consiste en células epiteliales bucales y glóbulos blancos. Estos se pueden sedimentar como se recomienda en el protocolo celular y recomendamos lavar el sedimento con PBS frío 1 o 2 veces. Será importante que haya suficientes células presentes, por lo que puede requerir un gran volumen de material de partida, ya que la densidad celular (y, por lo tanto, la cantidad de ADN) en el enjuague bucal tiende a ser baja. P: ¿Se pueden utilizar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras ambientales o fecales para estudios metagenómicos? R: No recomendamos nuestro kit para procesar muestras ambientales como suelo ni para procesar muestras fecales. Estas muestras presentan dos desafíos principales: ambas tienen una carga de nucleasas muy alta y contienen inhibidores muy difíciles de eliminar (ácido húmico para suelo, ácidos biliares para muestras fecales). La carga de nucleasas produce un ADN significativamente degradado, lo cual no es adecuado para el aislamiento de ADN HMW, y los inhibidores presentes en esas muestras no se eliminarán eficazmente con la química actual del kit. P: ¿Se pueden utilizar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para aislar ADN de BAC? R: No lo hemos probado, pero esperamos que funcione, ya que las construcciones de BAC tienen un tamaño óptimo para la unión a las microesferas. Sin embargo, las BAC suelen tener un número de copias muy bajo, y se necesitará una cantidad significativa de cultivo para acumular suficiente ADN de BAC para la unión a las microesferas (> 5 μg). Esto conducirá a un aumento en los volúmenes de tampón necesarios en la lisis alcalina. En total, el volumen de los 3 tampones de lisis alcalina no debe superar los 1100 μl para que el ADN aún pueda unirse a las perlas en un tubo de reacción de 2 ml. Es posible que se requiera algún trabajo de optimización, pero debería ser posible conectar la química de la lisis alcalina con la parte de unión y purificación de perlas de los protocolos Monarch. P: ¿Tiene algún resultado de secuenciación de PacBio de ADN extraído de muestras de tejido con los kits de extracción de ADN HMW de Monarch? R: Sí, hemos llevado a cabo experimentos comparativos con bibliotecas PacBio SMRTbell preparadas con ADN de células (HEK293), sangre (porcina), bacterias (E. coli) y muestras de tejido (riñón de ratón). En las ejecuciones con código de barras, todas las métricas de secuenciación fueron muy similares. Las bibliotecas preparadas con ADN HMW purificado por Monarch se han ejecutado con excelentes métricas en Sequel I y Sequel II. El ADN tuvo un buen rendimiento en secuenciaciones tradicionales y de alta fidelidad. P: ¿Funciona el flujo de trabajo de extracción de ADN Monarch HMW con células individuales? R: Lamentablemente, este flujo de trabajo no es compatible con células individuales. El sistema requiere una masa crítica de ADN (≥ 1 μg en ~100 μl) para una unión eficaz a las microesferas. P: ¿Se puede utilizar el ADN aislado con los kits de extracción de ADN Monarch HMW en Southern blots? R: Sí, el ADN extraído se puede utilizar para análisis Southern blots. Asegúrese de separar el ADN HMW en un gel de campo pulsado, ya que en los geles de agarosa convencionales, el ADN HMW se atasca en las ranuras del gel. P: ¿Se pueden utilizar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar nematodos? R: Sí. Hemos aislado con éxito ADN de alto peso molecular (HMW) de C. elegans con el kit de extracción de ADN Monarch HMW para tejido (NEB n.° T3060) siguiendo el protocolo estándar para muestras de tejido (se procesaron gusanos de dos placas). Recomendamos usar un homogeneizador de rotor-estator para la homogeneización de la muestra y obtener mejores resultados. P: Mi muestra de sangre está congelada en alícuotas mayores a las recomendadas en su protocolo (p. ej., en Vacutainers). ¿Puedo seguir usando el protocolo de sangre congelada para el kit de extracción de ADN Monarch HMW para células y sangre (NEB n.° T3050)? R: Sí, pero es importante no descongelar la muestra por completo (ni calentarla) si no está en presencia de tampón de lisis de eritrocitos, ya que al calentarla se activarán rápidamente las nucleasas. Incube el recipiente de sangre a temperatura ambiente hasta que esté a punto de comenzar a descongelarse (el color se tornará rojo más oscuro). Coloque el tubo en un rotador de tubos a 20 rpm y hágalo girar hasta que la muestra se haya descongelado casi por completo. Asegúrese de monitorear la muestra en el rotador con mucho cuidado para detectar el punto en el que está casi descongelada. En ese punto, agite brevemente en vórtex para finalizar la descongelación y disolver cualquier agregado y colóquela rápidamente en hielo. Tome una alícuota de sangre para su preparación (el volumen inicial recomendado es de 500 µl) y colóquela en un tubo de 2 ml. Agregue 3 volúmenes de tampón de lisis de glóbulos rojos frío, mezcle por inversión 5 veces y luego continúe con el protocolo de sangre congelada (Paso 5). Las muestras de sangre descongeladas no deben volver a congelarse. Alternativamente, puede descongelar la muestra de sangre muy ligeramente en un baño de agua a 37 °C, lo suficiente para desalojarla del recipiente y moverla a un recipiente más grande capaz de acomodar la adición de 3 volúmenes de tampón de lisis de glóbulos rojos frío. Luego, la muestra puede descongelarse en presencia de tampón de lisis de glóbulos rojos según el protocolo. Tenga en cuenta que este método puede requerir tampón de lisis de eritrocitos adicional (NEB n.° T3051L). P: Tengo problemas para disolver mi ADN de alto peso molecular (ADN de alto peso molecular) después del aislamiento. ¿Tiene algún consejo para aumentar la solubilidad? R: El ADN de alto peso molecular (ADN de alto peso molecular) es notoriamente difícil de disolver. Cuando las muestras de ADN están muy concentradas o contienen ADN de peso molecular ultraalto, disolverlo puede ser aún más complicado. En general, cuanto más compactado esté el ADN, más difícil será disolverlo. Las perlas de vidrio empleadas en los kits de extracción de ADN de alto peso molecular Monarch proporcionan una gran superficie alrededor de la cual el ADN se enrolla, lo que generalmente sirve para mantener el ADN en una conformación abierta, facilitando su disolución. Sin embargo, la solubilidad puede seguir siendo un problema. A continuación, se ofrecen algunos consejos para maximizar la solubilidad de su ADN al trabajar con los kits de extracción de ADN de alto peso molecular Monarch: Intente minimizar el tiempo que el ADN permanece unido a las perlas sin líquido. Después de eliminar el líquido de las perlas, añada el siguiente tampón inmediatamente. Cuanto más tiempo se seque el ADN en las perlas, más compacto será y más difícil será disolverlo posteriormente. Al unir el ADN a las perlas, no invierta la muestra más tiempo del recomendado. Cuanto más tiempo pase el ADN enrollado en las perlas, más compactado se compactará y más difícil será disolverlo posteriormente. Consulte nuestra guía de uso, Homogeneización de muestras de ADN de alto peso molecular (ADN HMW) después de la elución para obtener más consejos sobre la homogeneización de ADN HMW después de la elución. P: Las enzimas del kit no se almacenaron a -20 °C de inmediato. ¿Seguirán funcionando? R: Sí, las enzimas Monarch Proteinasa K y ARNasa A sin abrir son estables a temperatura ambiente a corto plazo. Después de abrirlas, la Proteinasa K y la ARNasa A Monarca deben almacenarse a -20 °C. P: Hay un precipitado en el tubo de la enzima Proteinasa K, ¿es esto normal? R: No es raro ver un precipitado blanco y amorfo en el tubo de Proteinasa K. No se ve afectada la actividad de la proteinasa K ni el funcionamiento del kit, por lo que puede continuar con su flujo de trabajo con normalidad. P: ¿Qué columnas y retenedores de microesferas Monarch® se pueden usar con cada tubo de recolección Monarch? R: Los tubos de recolección Monarch Spin (NEB n.° T2118) son compatibles con las columnas de purificación de ARN Monarch (NEB n.° T2007); las columnas de eliminación de ADNg Monarch (NEB n.° T2017); las columnas de limpieza de ARN Monarch (NEB n.° T2037, T2047 y T2057); las columnas de purificación de ADNg Monarch (NEB n.° T3017); y los retenedores de microesferas Monarch (NEB n.° T3004). Los tubos de recolección Monarch (NEB n.° T1018) son compatibles con las columnas de minipreparación de plásmidos Monarch (NEB n.° T1017) y las columnas de limpieza de ADN Monarch (NEB n.° T1034). Los tubos de recolección Monarch II (NEB n.° T2018) son compatibles con las columnas de limpieza de ARN Monarch (NEB n.° T2037, T2047 y T2057) (a través de lotes específicos); las columnas de purificación de ADNg Monarch (NEB n.° T3017) (a través de lotes específicos); y los retenedores de microesferas Monarch (NEB n.° T3004) (a través de lotes específicos). P: He observado que las dimensiones de los tubos de recolección han cambiado ligeramente en el kit de extracción de ADN Monarch® HMW para células y sangre (NEB n.° T3050) y el kit de extracción de ADN Monarch HMW para tejido (NEB n.° T3060). ¿Afectará esto al rendimiento? R: NEB está estandarizando la cantidad de plásticos que utilizamos en nuestros kits para reducir los residuos durante su producción. Los ligeros cambios en las dimensiones no afectarán al rendimiento del producto. P: He observado que estoy aplicando fuerza para encajar la columna en un tubo de recolección. ¿Debería hacerlo? ¿Qué tubos de recolección son compatibles con las columnas? R: Todos los kits Monarch® incluyen tubos de recolección compatibles para las columnas de centrifugación. Si utiliza tubos de recolección fuera de un kit específico, utilice los tubos de recolección Monarch® Spin Collection Tubes (NEB n.° T2118). No fuerce ninguna columna en tubos de recolección no recomendados que tengan un ajuste muy ajustado para evitar dañar la columna. P: He utilizado toda la proteinasa K (NEB n.° P8200) incluida en el kit Monarch. ¿Puedo comprar más? R: Sí, la proteinasa K, grado de biología molecular (NEB n.° P8107), está disponible para su compra independiente y puede utilizarse como sustituto directo de la (NEB n.° P8200) en todos los protocolos Monarch sin necesidad de modificaciones.