New England Biolabs, T3051L, tampón de lisis de glóbulos rojos Monarch©

Categorías relacionadas : Extracción de ADN de alto peso molecular, Purificación de ácidos nucleicos, Preguntas frecuentes. P: ¿Se pueden usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar la capa leucocítica humana? R: Sí, el kit de extracción de ADN Monarch HMW para células y sangre (NEB n.° T3050) se puede usar para procesar la capa leucocítica. Al trabajar con la capa leucocítica, que es una solución concentrada de PBMC, se deben usar cantidades de entrada menores que al trabajar con sangre. El recuento celular total no debe ser superior a 1 x 10⁻¹ células para el protocolo estándar (agitación a 2000 rpm) ni superior a 5 x 10⁻¹ células cuando se necesita ADN UHMW (baja agitación). La capa leucocítica obtenida de bancos de sangre contiene hasta 1 x 10⁻¹ PBMC por 30-80 ml, lo que equivale aproximadamente a 1 x 10⁻¹ - 3 x 10⁻¹ células/ml. Sugerimos comenzar con 100-300 μl de esta solución, agregar PBS a un volumen total de 500 μl y pasar al procedimiento de lisis de eritrocitos como si fuera una muestra de sangre de 500 μl. P: Mi muestra de sangre está congelada en alícuotas más grandes que las recomendadas en su protocolo (p. ej., en Vacutainers). ¿Puedo seguir usando el protocolo de sangre congelada para el Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood (NEB #T3050)? R: Sí, pero es importante no descongelar la muestra por completo (ni calentarla) cuando no esté en presencia de RBC Lysis Buffer, ya que permitir que la muestra se caliente activará rápidamente las nucleasas. Incube el recipiente de sangre a temperatura ambiente hasta que esté a punto de comenzar a descongelarse (el color se volverá rojo más oscuro). Coloque el tubo en un rotador de tubos a 20 rpm y gire hasta que la muestra se haya descongelado casi por completo. Asegúrese de monitorear la muestra en el rotador con mucho cuidado para detectar el punto en el que está casi descongelada. En ese punto, agite brevemente en vórtex para finalizar la descongelación y disolver cualquier agregado y colóquela rápidamente en hielo. Tome una alícuota de sangre para su preparación (el volumen inicial recomendado es de 500 µl) y colóquela en un tubo de 2 ml. Agregue 3 volúmenes de tampón de lisis de glóbulos rojos frío, mezcle por inversión 5 veces y luego continúe con el protocolo de sangre congelada (Paso 5). Las muestras de sangre descongeladas no deben volver a congelarse. Alternativamente, puede descongelar la muestra de sangre muy ligeramente en un baño de agua a 37 °C, lo suficiente para desalojarla del recipiente y moverla a un recipiente más grande capaz de acomodar la adición de 3 volúmenes de tampón de lisis de glóbulos rojos frío. Luego, la muestra puede descongelarse en presencia de tampón de lisis de glóbulos rojos según el protocolo. Tenga en cuenta que este enfoque puede requerir tampón de lisis de glóbulos rojos adicional (NEB n.° T3051L).