New England Biolabs, T3061L, tampón de lisis tisular de ADNg Monarch® HMW

Categorías relacionadas Extracción de ADN de alto peso molecular, Purificación de ácidos nucleicos Preguntas frecuentes P: ¿Puedo usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de plantas? R: No recomendamos este kit para la extracción de ADN de plantas. Los polisacáridos en los lisados ​​de plantas no se eliminan eficazmente con el tampón de lisis de tejido de gDNA HMW incluido, el tampón de lisis incluido en el kit de extracción de ADN Monarch HMW para tejido (NEB #T3060). La presencia de polisacáridos residuales impide la unión del ADN a las perlas de vidrio. Si tiene su propio sistema de lisis que pueda emplearse junto con nuestro flujo de trabajo, ciertamente lo alentamos a probarlo. Nuestro trabajo inicial destacó la importancia de comenzar con al menos 50 mg de tejido vegetal porque la eficiencia de unión a las perlas de vidrio requiere una masa crítica de ADN. El uso de cantidades de entrada más pequeñas no proporcionará suficiente ADN para permitir la unión a las perlas. Si se realiza una preparación de núcleos a partir de muestras de plantas, elija el kit de extracción de ADN Monarch HMW para células y sangre (NEB n.° T3050) para procesar los núcleos de las plantas (NEB no ha validado este método, pero invita a los usuarios a probarlo). Si los núcleos de las plantas están presentes en un tampón específico, utilice este tampón en lugar del tampón de preparación de núcleos. Como alternativa, sedimente los núcleos y resuspéndalos en el tampón de preparación de núcleos y siga el protocolo a partir de ahí. Le animamos a compartir sus comentarios sobre las pruebas de nuestra tecnología con muestras de plantas enviándonos un correo electrónico a info@neb.com. P: ¿Puedo usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de insectos? R: Hemos aislado con éxito ADN HMW de A. aegypti (15 mg) utilizando el protocolo de tejido estándar. Aunque no hemos validado internamente ningún otro insecto en este momento, otros han procesado con éxito moscas, polillas, artrópodos (escorpión) y algunos nematodos. Las siguientes consideraciones pueden ser útiles: Trabaje con muestras frescas si es posible; la congelación y descongelación puede activar la actividad de las nucleasas Cuando trabaje con insectos más grandes, recomendamos retirar el material intestinal (que es rico en nucleasas) antes de la homogeneización Es esencial una homogeneización completa con un mortero o un homogeneizador de rotor y estator, y es importante agregar rápidamente el tampón de lisis (que elimina las nucleasas) después de la homogeneización P: ¿Se puede usar el kit de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras de levaduras o hongos? R: Hemos validado nuestro kit para procesar muestras de levaduras y hemos publicado un protocolo basado en el trabajo con muestras de S. cerevisiae. No hemos probado internamente el kit en hongos filamentosos. Sin embargo, con base en nuestro trabajo en el desarrollo de nuestro kit de sílice (NEB #T3010), que usa una química de lisis similar, descubrimos que nuestra química puede funcionar para ciertos hongos cuando la muestra se congela en nitrógeno líquido y se muele hasta obtener un polvo fino usando un mortero. Para los hongos, se debe usar material de partida seco. Sin embargo, este enfoque tendría que probarse para su especie específica. P: ¿Se pueden usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras marinas, incluyendo invertebrados marinos? R: No hemos probado el kit en estos organismos. A menudo, estos organismos contienen una gran cantidad de material mucoso o polisacárido, lo que puede causar problemas durante la unión de las microesferas. Si cuenta con una química de lisis optimizada, puede emplearla antes de nuestro flujo de trabajo de microesferas utilizando el kit de extracción de ADN Monarch HMW para tejido (NEB n.° T3060). P: ¿Se pueden usar los kits de extracción de ADN Monarch HMW para procesar muestras ambientales o fecales para estudios metagenómicos? R: No recomendamos nuestro kit para procesar muestras ambientales como suelo ni para procesar muestras fecales. Estas muestras presentan dos desafíos principales: ambas tienen una carga de nucleasas muy alta y contienen inhibidores muy difíciles de eliminar (ácido húmico para suelo, ácidos biliares para muestras fecales). La carga de nucleasas produce una degradación significativa del ADN, lo cual no es adecuado para el aislamiento de ADN de alto peso molecular (HMW), y los inhibidores presentes en dichas muestras no se eliminarán eficazmente con la química actual del kit. P: ¿Se pueden utilizar los kits de extracción de ADN de alto peso molecular Monarch para aislar ADN de BAC? R: No hemos realizado pruebas, pero esperamos que funcione, ya que las construcciones de BAC tienen un tamaño óptimo para la unión a las microesferas. Sin embargo, las BAC suelen ser construcciones con un número de copias muy bajo, y se necesitará una cantidad significativa de cultivo para acumular suficiente ADN de BAC para la unión a las microesferas (> 5 μg). Esto aumentará el volumen de tampón necesario para la lisis alcalina. En total, el volumen de los tres tampones de lisis alcalina no debe superar los 1100 μl para que el ADN pueda seguir unido a las microesferas en un tubo de reacción de 2 ml. Puede que se requiera cierta optimización, pero debería ser posible conectar la química de la lisis alcalina con la unión a las microesferas y la purificación de los protocolos Monarch. P: ¿Cómo recomienda homogeneizar tejidos más resistentes, como punzones de oreja o músculo? ¿Se puede usar un sonicador para homogeneizar tejidos? R: Para homogeneizar muestras, recomendamos el mortero de microtubos incluido o la homogeneización de rotor-estator. No se recomienda la sonicación para la extracción de ADN de alto peso molecular (HMW), ya que se sabe que fragmenta el ADN. Para homogeneizar tejidos fibrosos, recomendamos las siguientes recomendaciones: El músculo se puede homogeneizar con el mortero de microtubos o un homogeneizador de rotor-estator. Consideramos que trabajar con el mortero es más conveniente, pero para muestras congeladas, el homogeneizador de rotor-estator ofrece longitudes de lectura N50 algo mejores. Los punzones de oreja y las puntas de cola funcionan mejor con el mortero de microtubos, ya que el homogeneizador de rotor-estator con puntas desechables (Tissueruptor II) no puede romper el tejido eficazmente. Es posible que el homogeneizador de rotor-estator con puntas metálicas afiladas no desechables sea una mejor opción, pero no lo hemos probado. Sin embargo, hemos obtenido excelentes resultados con punzones de oreja utilizando el mortero de microtubos. Básicamente, el mortero divide la muestra de punción de oreja en tres capas delgadas accesibles al tampón de lisis tisular y a la proteinasa K, lo que proporciona ADN de alto peso molecular (HMW) de muy buena calidad. Recomendamos usar dos punciones de oreja por muestra para una mayor eficiencia de unión. Las puntas de cola son muestras muy complejas. Idealmente, se utiliza un polvo obtenido moliendo con nitrógeno líquido. Si bien esta opción no está disponible, el mortero ayuda, pero la proteinasa K aún tarda varios minutos en lisar completamente el tejido homogeneizado. Como resultado, el ADN aislado de la cola del ratón está más fragmentado y es más pequeño que el aislado de las punciones de oreja. Por consiguiente, un paso corto de eliminación de lectura puede resultar en mejores longitudes de lectura en la secuenciación por nanoporos. P: ¿El kit funciona con tejido congelado, tejido almacenado en conservantes (etanol, sal DMSO/DESS o RNAlater®), muestras FFPE o tejidos conservados mediante OCT? R: Hemos probado con éxito varias opciones para la conservación de muestras de tejido congelado, pero siempre es mejor utilizar material de partida fresco siempre que sea posible. Cuando no se dispone de muestras frescas, la alternativa recomendada es la congelación, idealmente mediante congelación rápida con nitrógeno líquido y almacenamiento a -80 °C. Al descongelar, el objetivo es evitar que las nucleasas dañen el ADN, lo cual se puede garantizar homogeneizando rápidamente y mezclando con el tampón de lisis inmediatamente después de descongelar y homogeneizar la muestra. Curiosamente, las muestras de tejido congeladas suelen ofrecer mejores resultados en cuanto a la longitud e integridad de los fragmentos de ADN que las almacenadas con reactivos de conservación. Hemos probado el reactivo de protección de ADN/ARN Monarch (NEB n.° T2011), RNAlater, DNA/RNA Shield y RNAssist. Si bien estos reactivos conservan las muestras eficazmente, su presencia impide la digestión rápida del material tisular durante la fase inicial de la lisis, lo que parece provocar cizallamiento y daño al ADN. En nuestra experiencia, el reactivo de protección de ADN/ARN Monarch ofrece resultados ligeramente mejores que RNAlater y RNAssist. El tejido conservado en etanol puede utilizarse como material de partida. Antes de iniciar el procedimiento de lisis, se debe eliminar el etanol lavando las muestras con un tampón de salinidad media; puede solicitar más información (contáctenos en info@neb.com). Las células congeladas conservadas en DMSO se han analizado y han proporcionado ADN de buena calidad. No hemos probado el DESS, pero creemos que también debería funcionar. Las muestras FFPE no son adecuadas para el aislamiento de ADN de alto peso molecular (HMW), ya que presentan un alto grado de reticulación, lo que provoca una fracturación y desnaturalización significativas del ADN durante el riguroso proceso de purificación que requieren estas muestras. Normalmente, las muestras FFPE no son un material de partida ideal para quienes buscan ADN de alto peso molecular (HMW), ya que el ADN purificado suele ser <1 kb y estará desnaturalizado. Las muestras OCT podrían funcionar, ya que las muestras fijadas con OCT no presentan reticulación, pero no lo hemos comprobado. Animamos a los usuarios a probarlo con nuestros kits de prueba gratuitos. Siempre es recomendable comenzar en un rango intermedio de la cantidad de entrada recomendada (p. ej., 10-15 mg). Antes de iniciar la extracción de ADN, elimine la mayor cantidad posible de OCT. P: ¿Observa resultados de fragmentación diferentes al usar el mortero de mano en comparación con el homogeneizador de rotor-estator para la homogeneización de tejidos? R: Si el objetivo es aislar ADN ultra HMW, la homogeneización con mortero de microtubos es la mejor opción. El homogeneizador de rotor-estator (RSH) es una alternativa eficiente, pero el ADN HMW que se libera en el lisado puede sufrir un ligero cizallamiento durante el proceso de homogeneización. Por lo tanto, para recuperar los fragmentos de ADN más largos con el RSH, se debe usar en la configuración más baja y el dispositivo debe apagarse inmediatamente una vez que los fragmentos de tejido estén completamente fragmentados. Generalmente, para la homogeneización con mortero de mano, cuanto más completamente se homogeneice una muestra, menor será el tiempo de lisis y más grande y más intacto estará el ADN. La muestra debe triturarse en la capa más fina posible para que la lisis por proteinasa K se produzca rápidamente. Sin embargo, la estructura del tejido también influye en la velocidad de lisis y, en consecuencia, en la longitud del fragmento. El tejido de órganos blandos y el cerebro se lisan en segundos y producen los fragmentos más largos. El tejido muscular puede necesitar un poco más de tiempo, pero debe lisarse en aproximadamente un minuto. El tejido fibroso muy rígido (p. ej., la cola de un ratón) necesita varios minutos para lisarse por completo y, por lo tanto, tiende a producir fragmentos de ADN más cortos. Dado que las células tisulares no pueden resuspenderse libremente como las células cultivadas, partes de las células se lisan simultáneamente, lo que causa cierto grado de enredo del ADN de alto peso molecular. Este enredo puede observarse como una mancha ascendente en una línea de gel de campo pulsado. El tratamiento con un homogeneizador de rotor-estator puede separar estos agregados, en su mayor parte. Sin embargo, las muestras tratadas con mortero, en particular cuando se utiliza tejido congelado, pueden requerir cierto corte con aguja para resolver estos agregados de ADN y obtener resultados óptimos de secuenciación de lectura larga. Las técnicas de homogeneización con mortero y rotor-estator producen fragmentos de diferentes longitudes El ADN genómico de alto peso molecular (HMW) se purificó a partir de tejidos de órganos blandos (riñón de ratón, hígado de ratón, 10 mg), tejidos grasos (cerebro de ratón, 20 mg) y fibrosos (músculo de ratón, 20 mg) junto con bacterias Gram y Gram + (E. coli, 2 x 108 células y B. cereus, 2 x 109 células) que se purificaron utilizando el kit de extracción de ADN Monarch HMW para tejidos con varios métodos de homogeneización: mortero (P), homogeneizador de rotor-estator TissueRuptor II) (R) o mezclador térmico (T). 300 ng de ADN de cada muestra se resolvieron en un gel Pippin Pulse™ (Sage Science) con el programa para 5–430 kb. El cizallamiento vigoroso inducido por el homogeneizador de rotor-estator redujo la longitud del fragmento en comparación con la homogeneización con mortero + agitación en un mezclador térmico.