Qiagen, 1027295, AllStars Neg. ARNip AF 647 (20 nmol)

ARNi no silenciador completamente probado y validado, modificación Alexa Fluor 647

Características

- El control negativo más completamente validado disponible
- No hay homología con ningún gen de mamífero conocido.
- Efectos inespecíficos mínimos
- Se puede utilizar en experimentos de imitación de miRNA.

Actuación

Tipo de prueba: Nombre de la prueba
Análisis de todo el genoma: matrices GeneChip de Affymetrix
Ensayo basado en células: tinción de núcleos de células vivas
Ensayo basado en células: Número de células
Ensayo basado en células: incorporación de nucleótidos
Ensayo basado en células: exclusión de colorante de células vivas
Ensayo basado en células: tinción de ADN
Análisis de incorporación de RISC (células HeLa y MCF-7): transfección de construcción de reportero

- Se generó un constructo reportero que contenía una secuencia diana de ARNi artificial complementaria a la secuencia de ARNi de control negativo AllStars fusionada a un gen reportero fluorescente con una etiqueta His (ver figura "Construcción reportera para el experimento de incorporación de RISC").
El constructo reportero se cotransfectó con ARNi de control negativo AllStars o con un ARNi no complementario. También se analizaron las células no transfectadas.
Se realizaron microscopía de fluorescencia y FACS para detectar la expresión del gen reportero fluorescente. Se realizó un análisis Western blot para detectar la expresión de la proteína de fusión a través de su etiqueta His. La cotransfección del constructo reportero con un ARNi no complementario resultó en una fuerte expresión de la proteína fluorescente y la etiqueta His. Al cotransfectar el constructo con el ARNi de control negativo AllStars, este inhibió la expresión de su secuencia complementaria, lo que resultó en la degradación de todo el transcrito de ARNm que codifica el gen reportero fluorescente, la etiqueta His y la secuencia diana del ARNi. La degradación del ARNm resultó en la inactivación de la proteína de fusión (véanse las figuras «El ARNi de control negativo AllStars se incorpora a RISC» y «El análisis Western muestra que el ARNi de control negativo AllStars entra en RISC»). Para lograr la inactivación observada, el ARNi de control negativo AllStars debe haber entrado en RISC.

El rendimiento del ARNi de control negativo AllStars se validó mediante experimentos que se muestran en la tabla.

Matrices GeneChip de Affymetrix

Se realizó un análisis genómico completo para evaluar el nivel de efectos inespecíficos sobre la expresión génica tras la transfección de múltiples ARNip de control negativo. Se transfectaron múltiples ARNip de control negativo de diferentes orígenes en células MCF-7, K562 y células HUVEC primarias utilizando el reactivo de transfección HiPerFect. Estos incluyeron ARNip no silenciadores (sin homología con genes de mamíferos), ARNip codificados (ARNip con la misma composición de bases que el ARNip específico del gen, pero con una secuencia alterada) y ARNip dirigidos a genes reporteros artificiales. Posteriormente, se realizó el perfil de expresión de todo el genoma humano con arrays GeneChip de Affymetrix. El ARNip de control negativo AllStars presentó sistemáticamente el menor número de genes regulados inespecíficamente, lo que lo convierte en un control negativo muy adecuado. Por el contrario, otros ARNip de control negativo resultaron en una regulación inespecífica de numerosos genes de vías celulares importantes (véase la figura "Bajos efectos inespecíficos sobre la expresión").

Tinción de núcleos de células vivas

Se utilizó la tinción de núcleos de células vivas para medir el tamaño nuclear. Los cambios de tamaño podrían indicar una alteración del ciclo celular o una inhibición del crecimiento. Se analizaron diversos ARNip de control negativo de diferentes tipos. El ARNip de control negativo AllStars obtuvo los mejores resultados de todos los controles analizados. La transfección del ARNip de control negativo AllStars no produjo cambios en el tamaño nuclear en comparación con las células no transfectadas. Por el contrario, la transfección de otro ARNip de control negativo (Control 1) produjo un agrandamiento de los núcleos (véase la figura "Fenotipo de tamaño nuclear no afectado").

Número de celular

Se evaluó el número de células tras la transfección de una serie de ARNip de control negativo para determinar si las células proliferaban con normalidad. Prácticamente no se observó diferencia en el número de células entre las células no transfectadas y las transfectadas con el ARNip de control negativo AllStars. Por el contrario, el número de células se redujo significativamente tras la transfección con otros ARNip de control negativo analizados, como el Control 1, lo que indica que estos ARNip dieron lugar a un fenotipo de defecto de crecimiento (véase la figura "Número de células no afectado").

Incorporación de nucleótidos

Se midió la incorporación de nucleótidos para determinar la tasa de síntesis de ADN en células HCT-116 no transfectadas y en células HCT-116 transfectadas con diferentes ARNip de control negativo. La incorporación de nucleótidos se midió examinando la captación de bromodesoxiuridina (BrdU), un análogo básico de la timidina que sustituye a la timidina durante la replicación del ADN y se incorpora al ADN recién sintetizado. Los cambios en la tasa de síntesis de ADN podrían indicar alteraciones del crecimiento celular o del ciclo celular. Las células transfectadas con el ARNip de control negativo AllStars mostraron una tasa de incorporación de BrdU muy similar a la de las células no transfectadas. Sin embargo, otro ARNip de control negativo analizado (Control 1) presentó un perfil alterado con un menor nivel de síntesis de ADN, lo que indica que este ARNip afecta el crecimiento celular o el ciclo celular (véase la figura "Fenotipo de síntesis de ADN normal").

Exclusión de colorante de células vivas

Se utilizó la exclusión de colorante de células vivas para medir los posibles efectos citotóxicos de una variedad de ARNip de control negativo. Los resultados mostraron que las células transfectadas con el ARNip de control negativo AllStars y las células no transfectadas presentaron un número similar de células vivas y muertas. Por el contrario, otros ARNip de control negativo resultaron en un aumento de la citotoxicidad (véase la figura "Sin aumento de los efectos citotóxicos").

Tinción de ADN para el análisis del ciclo celular

La tinción de ADN tras la fijación celular se utilizó para medir la distribución del ciclo celular (la cantidad de células en las fases G1/G0, S y G2 del ciclo celular). Tras la transfección del ARNip de control negativo AllStars, la proporción de células en cada fase fue similar a la observada en las células no transfectadas (véase la figura "Distribución normal del ciclo celular"). Este resultado demuestra que el ARNip de control negativo AllStars no afecta negativamente al ciclo celular.

Transfección de la construcción del reportero para evaluar la incorporación a RISC

Para realizar experimentos precisos de ARNi de control negativo, el ARNi de control negativo debe incorporarse al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Esto significa que el ARNi de control pasa por el mismo proceso biológico que el ARNi específico del gen y permite comparar los datos del ARNi específico del gen con los del ARNi de control negativo para determinar con seguridad los resultados debidos a la inhibición del gen diana.

Los experimentos se realizaron de la siguiente manera:

Principio

La transfección de un ARNip de control negativo es esencial en todo experimento de ARNi. Los resultados del control negativo deben compararse con los de las células no transfectadas. Idealmente, la expresión génica y el fenotipo deberían ser similares tanto en las células no transfectadas como en las transfectadas con el ARNi de control negativo. Si se observan alteraciones en la expresión o el fenotipo en las células transfectadas con el ARNi de control negativo, estos cambios son inespecíficos: se deben a los procedimientos de transfección o a la toxicidad del ARNi, y no a la complementariedad de la secuencia. Los efectos inespecíficos deben ser mínimos para garantizar resultados fiables de ARNi/miARN.

Los resultados del control negativo también pueden compararse con los del ARNi/miARN específico del gen en estudio. Esta comparación permite al investigador identificar con precisión los efectos de la inhibición del gen diana en la expresión génica y el fenotipo, ya que la muestra de control negativo ha experimentado el mismo proceso biológico, con la única diferencia en la secuencia del ARNi/miARN.

Procedimiento

- Comparar con los resultados de células no transfectadas para determinar si la configuración experimental causa efectos no específicos.
- Comparar con los resultados del ARNi específico del gen para identificar los efectos de la eliminación del gen objetivo
- En experimentos de imitación de miRNA, compárelos con los resultados de imitadores de miRNA específicos de genes para identificar los efectos de la regulación negativa del objetivo.

Los resultados del ARNi de control negativo AllStars se pueden utilizar de la siguiente manera:

Aplicaciones

- Todos los experimentos rutinarios de ARNi
- Puesta en marcha de experimentos de ARNi
- Cribado de ARNi de alto rendimiento
- Experimentos que involucran la transfección imitadora de miRNA