Qiagen, 1054575, Kit Giga EF de plásmido de alta velocidad (5)

Kit Giga EF de plásmidos de alta velocidad (5)

Características

- Aproximadamente 50 minutos de tiempo de preparación.
- Aclaramiento del lisado y precipitación con isopropanol sin centrifugación
- No hay riesgo de pérdida de pellets de ADN durante la precipitación
- Rendimiento de hasta 10 mg de ADN plasmídico de alto número de copias
- LyseBlue para una lisis óptima y un rendimiento máximo de ADN
- Eliminación de endotoxinas incluida (<0,04 EU/μg ADN)

Detalles del producto

Los kits HiSpeed ​​Plasmid Mega y Giga EF permiten la preparación de ADN plasmídico mediante intercambio aniónico a gran escala y al vacío. Solo requieren un paso de centrifugación para eluir el ADN plasmídico final. El ADN purificado es equivalente al obtenido mediante centrifugación en gradiente de CsCl 2x y es apto para aplicaciones de transfección. Se requiere un colector de vacío QIAvac HiSpeed ​​LS para este protocolo.

Los kits HiSpeed ​​EF Mega Giga deben utilizarse junto con el QIAvac HiSpeed ​​LS.

Actuación

Los kits HiSpeed ​​Plasmid Mega y Giga EF contienen cartuchos QIAfilter, puntas HiSpeed ​​y módulos QIAconcentrator para la preparación rápida y a gran escala de plásmidos con colector de vacío. El módulo QIAfilter, accionado por vacío, sustituye la centrifugación en el procedimiento clásico de intercambio aniónico, lo que agiliza y simplifica la purificación. El QIAconcentrator proporciona ADN altamente concentrado mediante centrifugación tras la precipitación con etanol. Se pueden purificar hasta 2,5 mg (Mega) o 10 mg (Giga) de ADN plasmídico de alto número de copias a partir de cultivos de 500 ml o 2,5 l, respectivamente (los volúmenes de cultivo dependen del número de copias del plásmido, el tamaño del inserto, la cepa huésped y el medio de cultivo). El diseño de la punta HiSpeed ​​permite un caudal muy alto, lo que permite la unión del ADN, el lavado y la elución para una purificación más rápida del plásmido. El ADN plasmídico derivado de HiSpeed ​​está libre de endotoxinas (<0,04 UE/µg de ADN).

La exclusiva resina de intercambio aniónico de las puntas HiSpeed ​​está desarrollada exclusivamente para la purificación de ácidos nucleicos. Sus excepcionales propiedades de separación dan como resultado una pureza del ADN equivalente o superior a la obtenida mediante dos rondas sucesivas de centrifugación en gradiente de CsCl. Los kits HiSpeed ​​Plasmid Mega y Giga EF eliminan las endotoxinas bacterianas liberadas durante la lisis e influyen en la transfección del ADN en células primarias y células cultivadas sensibles. El ADN libre de endotoxinas obtenido con los kits HiSpeed ​​Plasmid Mega/Giga EF es ideal para obtener resultados reproducibles y fiables en la transfección. El ADN ultrapuro libre de endotoxinas de QIAGEN también es adecuado para la investigación en terapia génica y otras aplicaciones sensibles.

Principio

Características: Kit HiSpeed ​​Plasmid Mega EF
Aplicaciones: Transfección, clonación, secuenciación, silenciamiento de genes.
Volumen de cultivo/material de partida: 500 ml de volumen de cultivo
Tipo de plásmido: ADN cósmido de alto número de copias
Procesamiento: Vacío, centrifugación
Muestra por ejecución: 6 muestras por ejecución
Tecnología: Tecnología de intercambio aniónico
Tiempo por carrera: 50 min
Rendimiento: 2,5 mg

Los cartuchos QIAfilter (véase la figura "Cartucho QIAfilter Mega-Giga") son unidades de filtración especiales diseñadas para sustituir el paso de centrifugación tras la lisis alcalina de células bacterianas. Los cartuchos QIAfilter eliminan completamente los precipitados de SDS y aclaran los lisados ​​bacterianos en una fracción del tiempo necesario para la centrifugación. Las puntas HiSpeed ​​preempaquetadas funcionan por gravedad y nunca se secan, lo que minimiza el tiempo de preparación manual de plásmidos.

El exclusivo QIAconcentrator (véase la figura "Procedimiento HighSpeed ​​Plasmid Giga EF") sustituye el paso de centrifugación utilizado tradicionalmente para recolectar ADN precipitado con isopropanol tras la purificación. El módulo QIAconcentrator atrapa el ADN precipitado, mientras la mezcla de isopropanol y tampón fluye a través de él. A continuación, el ADN se eluye del QIAprecipitator a un tubo de recolección con tampón TE o agua. Este módulo único también elimina el riesgo de pérdida de pellets, que puede producirse durante la decantación del sobrenadante tras la centrifugación.

Las endotoxinas, también conocidas como lipopolisacáridos o LPS, son componentes de la membrana celular de bacterias gramnegativas como E. coli (véase la figura "Pared celular bacteriana"). Las endotoxinas se liberan durante la lisis de la purificación de plásmidos y reducen significativamente la eficiencia de la transfección en líneas celulares sensibles a las endotoxinas. Además, las endotoxinas pueden influir en la captación de ADN plasmídico en experimentos de transfección al competir con el ADN por el reactivo de transfección "libre".

Las endotoxinas también inducen la activación inespecífica de respuestas inmunitarias en células inmunitarias como macrófagos y linfocitos B, lo que puede llevar a una interpretación errónea de los resultados de la transfección. Estas respuestas incluyen la síntesis inducida de proteínas y lípidos como IL-1 y prostaglandinas. En general, las endotoxinas representan una variable no controlable en la configuración de los experimentos de transfección, lo que influye en el resultado y la reproducibilidad de los resultados, dificultando su comparación e interpretación. En la investigación en terapia génica, las endotoxinas pueden interferir causando el síndrome de shock endotóxico y la activación de la cascada del complemento.

Procedimiento

Los lisados ​​bacterianos neutralizados se incuban en el cartucho QIAfilter y se purifican en segundos mediante vacío. En esta etapa, se añade el tampón de eliminación de endotoxinas al lisado filtrado. No se requiere incubación. El filtrado se aplica a una punta HiSpeed ​​para la purificación del ADN plasmídico (véase la figura "Procedimiento HighSpeed ​​Plasmid Giga EF"). El ADN eluido se mezcla con isopropanol, se aplica al QIAconcentrator mediante vacío y se lava. El ADN concentrado y desalinizado se eluye del QIAconcentrator directamente a un tubo de recolección limpio con tampón TE o agua.

Aplicaciones

El ADN purificado con los kits HiSpeed ​​Plasmid Mega y Giga EF produce excelentes resultados en todas las aplicaciones, desde la clonación y secuenciación hasta la transfección de células muy sensibles y células primarias y el silenciamiento de genes mediado por plásmidos.