Qiagen, 150035, Kit mini ultrarrápido REPLI-g (100)

ADN polimerasa, tampones y reactivos para reacciones de amplificación ultrarrápida del genoma completo de 100 x 20 μl

Características

- El ADN amplificado se puede utilizar en aplicaciones de NGS, microarrays y PCR.
- Amplificación de desplazamiento múltiple isotérmica (MDA) con ADN polimerasa de corrección de pruebas
- La amplificación del genoma completo (WGA) produce de 7 a 40 µg de ADN amplificado a partir de 10 ng de ADN.
- Formato ultrarrápido para la amplificación del genoma completo en 1 a 1,5 horas
- Formato de alto rendimiento para 96 ​​muestras con solo 20 minutos de tiempo de manipulación

Detalles del producto

Las limitaciones en el número y tipo de análisis genómicos que se pueden realizar debido a cantidades insuficientes de ADN genómico se pueden superar mediante la amplificación global de todo el ADN dentro de una muestra (amplificación del genoma completo). Los kits REPLI-g proporcionan ADN polimerasa, tampones y reactivos para una amplificación del genoma completo altamente uniforme con un sesgo de secuencia mínimo y se pueden utilizar con diversos materiales de partida, incluyendo ADN genómico, sangre fresca o seca, hisopos bucales, tejido y células frescas o congeladas. Los kits QIAGEN REPLI-g están disponibles en varios tamaños y configuraciones diferentes, lo que permite a los investigadores crear el mejor flujo de trabajo para su aplicación y espacio de laboratorio. Los rendimientos típicos de REPLI-g varían de aproximadamente 7 µg a 40 µg de ADN amplificado, dependiendo del kit y el flujo de trabajo utilizado.

Los kits REPLI-g Mini y Midi ofrecen un flujo de trabajo en un solo tubo con mayor rendimiento de ADN amplificado, mientras que el kit REPLI-g UltraFast permite una amplificación del genoma completo altamente uniforme y precisa en tan solo 60-90 minutos. Para un procesamiento de alto rendimiento en formato de 96 pocillos, el procedimiento optimizado a temperatura ambiente del kit de cribado REPLI-g permite una manipulación sencilla de líquidos en tan solo 20 minutos. El kit de cribado REPLI-g está diseñado para un cribado rápido mediante una gama de ensayos de genotipado, PCR, secuenciación o microarrays.

Actuación

Altos rendimientos a partir de una variedad de muestras, adecuado para numerosas aplicaciones.

Los kits REPLI-g Mini y Midi permiten utilizar diversas muestras de investigación clínica y no clínica, incluyendo ADN genómico, sangre fresca o seca, tejido y células frescas o congeladas. La producción típica de ADN por reacción de 50 µl alcanza de forma constante 10 µg (kit mini) o 40 µg (kit midi) (véase la figura "Producción uniforme de ADN con cualquier tipo de muestra"), mientras que se suele obtener una producción uniforme de ADN amplificado independientemente de la cantidad de ADN molde (véase la figura "Producción uniforme de ADN a partir de distintas cantidades de ADN molde"). Obtener una producción uniforme de ADN a partir de diferentes concentraciones de ADN molde es siempre importante, pero especialmente esencial para aplicaciones de alto rendimiento, que requieren la realización de análisis genéticos posteriores sin necesidad de mediciones ni ajustes adicionales de la concentración de ADN.

El rendimiento promedio de ADN del kit REPLI-g UltraFast Mini es de 7-10 µg por reacción de 20 µl en 90 minutos con muestras de calidad estándar. Si el tiempo es muy limitado, se dispone de suficiente producto para el análisis genético posterior en tan solo 45 minutos (véase la figura "Rendimiento constante y alto de ADN amplificado"). Las muestras de control negativo (sin ADN molde) no se amplifican, lo que proporciona un indicador fiable de la presencia o ausencia de ADN de muestra o contaminante (véase la figura "Rendimiento constante y alto de ADN amplificado").

Los rendimientos típicos de ADN de una reacción del kit de cribado REPLI-g son de 8 µg por 40 µl de reacción. El ADN amplificado se puede utilizar directamente en diversas aplicaciones posteriores, como la genotipificación (p. ej., SNP, STR, deleciones e inserciones), la PCR de punto final, la PCR cuantitativa en tiempo real, la micromatriz y la secuenciación. A diferencia de otros procedimientos de amplificación del genoma completo que requieren que la reacción se configure en hielo, el kit de cribado REPLI-g utiliza una configuración a temperatura ambiente con tan solo 20 minutos de tiempo de manipulación, lo que lo hace especialmente adecuado para procesar múltiples muestras en paralelo. Obtener rendimientos uniformes de ADN a partir de concentraciones variables de plantilla es especialmente importante en aplicaciones de alto rendimiento para permitir el análisis genético posterior sin necesidad de medir ni ajustar la concentración de ADN. La longitud media del producto suele ser superior a 10 kb, con un rango de entre 2 kb y 100 kb (véase la figura "Rendimiento uniforme de ADN de alto peso molecular").

La longitud promedio del producto de ADN amplificado con REPLI-g suele ser superior a 10 kb, con un rango de entre 2 kb y 100 kb, lo que permite aplicaciones posteriores como análisis complejos de enzimas de restricción y PCR de largo alcance. El ADN amplificado con REPLI-g es ideal para aplicaciones de genotipado, como el genotipado de SNP con conjuntos de cebadores/sondas TaqMan® (véase la figura "Genotipado fiable de SNP"), la secuenciación y el análisis de STR/microsatélites (véase la figura "Genotipado preciso").

Comentarios de los investigadores

En los últimos dos años, hemos utilizado ampliamente el kit REPLI-g Ultra Fast Mini en diversos proyectos. La amplificación por desplazamiento múltiple realizada con el kit REPLI-g permitió amplificar fielmente todos los productos de ADN con una tasa de error muy baja y una alta cobertura. Las aplicaciones posteriores para las que hemos utilizado el kit incluyen principalmente NGS, pero también qPCR y microarrays. Además, estamos trabajando en la implementación de esta tecnología en sistemas microfluídicos o de laboratorio en un chip, ya que el método no requiere un sofisticado programa de termociclado. Dr. Rong Fan, Profesor Adjunto de Ingeniería Biomédica, Universidad de Yale, EE. UU.

Utilizado con éxito en la secuenciación de próxima generación

Numerosas publicaciones han demostrado el uso exitoso del ADN amplificado REPLI-g para aplicaciones de secuenciación de próxima generación (NGS) que van desde la secuenciación del exoma y del genoma completo de células tumorales, hasta la investigación metagenómica y el análisis de células individuales (para una gama de publicaciones recientes que utilizaron con éxito REPLI-g en NGS, consulte nuestra página de recursos WGA). Dado que el uso de ADN amplificado del genoma completo para NGS y aplicaciones de matriz se ha debatido, detectamos factores potenciales que podrían influir en el éxito del uso de ADN amplificado para estas aplicaciones posteriores. Determinamos que la calidad del material de entrada influye fuertemente en el éxito de los experimentos NGS posteriores. Si se trabaja con ADN de baja calidad (p. ej., ADN degradado) o material de tejido envejecido, el ADN amplificado resultante puede no dar resultados confiables (datos no mostrados). Sin embargo, WGA, utilizando tecnología REPLI-g, en células intactas o ADN purificado no degradado muestra que los resultados de NGS son comparables a los obtenidos con ADNg purificado. La cobertura de secuencia y la comparación de alineamiento de la secuencia de loci genómicos indican niveles minimizados de ADN basura después de WGA, mientras que las tasas de error están en un rango de porcentaje similar para el ADN amplificado y genómico (ver figura “Resultados comparables de NGS (secuenciación de próxima generación) obtenidos usando ADNg purificado o ADN amplificado REPLI-g”). Los kits de biblioteca de ARN de célula única QIAseq FX y ADN de célula única QIAseq FX utilizan la reacción MDA REPLI-g para bibliotecas NGS de alta calidad cuando se comienza con 10 pg – 1 ng de ARN o ADN.

Amplificación del genoma completo de alta fidelidad

La tecnología REPLI-g proporciona una amplificación de ADN altamente uniforme en todo el genoma. La polimerasa Phi29 puede replicarse hasta 70 kb sin disociarse del molde de ADN genómico (véase la figura "Representación esquemática de la amplificación REPLI-g"). A diferencia de las tecnologías de amplificación de genoma completo (WGA) basadas en PCR, la polimerasa Phi29 presenta una actividad de corrección de errores de exonucleasa 3'→5' y mantiene una fidelidad hasta 1000 veces mayor que la ADN polimerasa Taq durante la replicación. Los cebadores resistentes a exonucleasas incluidos en el kit garantizan una alta producción de ADN, y el sistema de tampón WGA está optimizado para longitudes de lectura muy largas y una representación de locus imparcial.

REPLI-g supera a los métodos WGA basados ​​en PCR

Los métodos tradicionales de amplificación de ADN genómico incluyen el laborioso proceso de creación de líneas celulares transformadas con VEB, seguida de la amplificación del genoma completo mediante PCR aleatoria o con oligonucleótidos degenerados. Además, los métodos basados ​​en PCR (p. ej., DOP-PCR y PEP), generalmente utilizados por otros proveedores, pueden producir artefactos de amplificación inespecíficos y una cobertura incompleta de los loci. En algunos casos, se puede generar ADN de menos de 1 kb de longitud que no puede utilizarse en muchas aplicaciones posteriores. En general, el ADN resultante se genera con una tasa de mutación mucho mayor debido al uso de la enzima Taq ADN polimerasa de baja fidelidad, lo que puede provocar una amplificación propensa a errores que resulta, por ejemplo, en mutaciones de un solo par de bases, contracciones y expansiones de STR. A pesar de estas desventajas, REPLI-g proporciona una amplificación altamente uniforme en todo el genoma, con un sesgo de locus mínimo y tasas de mutación minimizadas durante la amplificación (véanse las figuras "Amplificación altamente representativa con tecnología REPLI-g" y "Amplificación del genoma completo consistente y precisa").

Principio

Principio de amplificación

A menudo, falta suficiente ADN genómico para el análisis genómico, lo que limita los análisis que se pueden realizar. La amplificación del genoma completo (WGA) supera esta limitación mediante la amplificación de todo el genoma dentro de una muestra, proporcionando cantidades suficientes para realizar todos los análisis en la misma muestra de ADN. La tecnología REPLI-g ofrece una amplificación de ADN altamente uniforme en todo el genoma con un sesgo de secuencia mínimo.

El método se basa en la tecnología de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), que utiliza la amplificación isotérmica del genoma con una polimerasa Phi 29 exclusivamente procesiva que es capaz de replicar hasta 100 kb sin disociarse de la plantilla de ADN genómico (véase la figura “Tecnología de amplificación por desplazamiento múltiple [MDA]”). La polimerasa Phi 29 se utiliza en presencia de cebadores resistentes a la exonucleasa para lograr altos rendimientos de producto de ADN y tiene una actividad de corrección de pruebas de exonucleasa 3'→5' con una fidelidad 1000 veces mayor que la polimerasa Taq para mantener una alta fidelidad durante la replicación. Con el apoyo del sistema de tampón REPLI-g único y optimizado, la polimerasa Phi 29 resuelve fácilmente las estructuras secundarias como los bucles de horquilla, evitando así el deslizamiento, la detención y la disociación de la polimerasa durante la amplificación. Esto permite la generación de fragmentos de ADN de hasta 100 kb sin sesgo de secuencia (ver figura "Amplificación imparcial con la polimerasa Phi 29").

Desnaturalización alcalina del ADN

El ADN genómico debe desnaturalizarse antes de su uso en procedimientos de amplificación enzimática, lo que a menudo se logra mediante métodos agresivos como la incubación a temperaturas elevadas (incubación por calor) o pH elevado (incubación química alcalina). Los kits REPLI-g utilizan una incubación alcalina suave, lo que permite una desnaturalización uniforme del ADN con una fragmentación muy baja o la generación de sitios abásicos. Esto da como resultado un ADN amplificado con una integridad muy alta y maximiza la longitud de los fragmentos amplificados, de modo que los loci y las secuencias genómicas se representan de manera uniforme. Con los kits REPLI-g, se garantizan resultados fiables sin falsos positivos ni negativos en aplicaciones posteriores, a diferencia de otras tecnologías de WGA que utilizan la desnaturalización inducida por calor, que puede dañar el ADN molde, lo que resulta en loci sesgados e infrarrepresentados (véase la figura "Efecto del calor y la desnaturalización alcalina en la representación de loci").

Procedimiento

REPLI-g Célula única: REPLI-g Mini
Material de partida: células individuales, ADNg
Cantidad de entrada: células individuales, 2–1000 células, tejido, ADNg purificado (1–10 ng)
Rendimiento (µg/reacción): 40
Tiempo de reacción: 8–16 h
Tiempo de práctica: 15 min
Formato: Tubo

Los kits REPLI-g Mini y Midi utilizan un método sencillo y fiable para lograr una amplificación genómica precisa a partir de pequeñas cantidades de ADN genómico diana aislado, o directamente de sangre completa, tarjetas de sangre seca, capa leucocítica y células de cultivo tisular (véase la figura "Procedimiento REPLI-g Mini y Midi"). Tras la adición del tampón de lisis, que lisa la muestra y desnaturaliza el ADN, se realiza una breve incubación de un minuto (véase la figura "Procedimiento REPLI-g Mini y Midi"). Tras la neutralización, se añade la mezcla maestra (incluida la ADN polimerasa REPLI-g Mini) y la reacción de amplificación isotérmica se lleva a cabo durante la noche a 30 °C. El ADN amplificado con REPLI-g puede conservarse a largo plazo a –20 °C sin efectos negativos (véase la figura "Estabilidad constante a largo plazo").

La amplificación de ADN genómico con el kit REPLI-g UltraFast Mini consta de tres pasos básicos (véase la figura "Procedimiento de purificación de ADN genómico"). Primero, la muestra (10 ng de ADN genómico purificado, 0,5 µl de sangre completa o 300 células de cultivo tisular) se somete a una desnaturalización alcalina suave, evitando la fragmentación y el daño del ADN molde. A continuación, la muestra se neutraliza y, finalmente, se incuba con ADN polimerasa REPLI-g UltraFast a 30 °C. El ADN amplificado está listo para usar después de 60 minutos sin necesidad de purificación adicional.

El método de cribado REPLI-g, muy rápido, sencillo y preciso, permite la amplificación paralela de varias muestras genómicas, como se describe en el Manual de Cribado REPLI-g. La muestra se lisa y el ADN se desnaturaliza mediante incubación con el tampón SB1 a 65 °C. La desnaturalización se detiene enfriando a temperatura ambiente. Se añaden el tampón SB2 y la ADN polimerasa, y la amplificación isotérmica continúa durante al menos 10 horas o toda la noche a 30 °C.

Toda la configuración de la reacción se realiza a temperatura ambiente, lo que facilita su uso con instrumentación de manejo de líquidos. La configuración de la reacción para 96 ​​muestras solo toma 20 minutos, lo que permite concentrarse en otras tareas importantes. El kit de cribado REPLI-g combina diversas características que lo hacen ideal para el cribado de mutaciones manual o automatizado de alto rendimiento, incluyendo pasos de pipeteo de gran volumen para una mayor precisión, compatibilidad con microplacas de 96 pocillos y un protocolo optimizado para una configuración rápida y sencilla (véase el diagrama de flujo "Procedimiento de cribado REPLI-g").

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Aplicaciones

- El genoma amplificado de REPLI-g se puede utilizar en una variedad de aplicaciones posteriores, entre las que se incluyen:
- Genotipado de SNP con conjuntos de cebadores/sondas TaqMan ®
- detección de mutaciones basada en qPCR y PCR
- Secuenciación de próxima generación
- Análisis STR/microsatélites
- Secuenciación de Sanger
- Análisis RFLP y Southern blot
- Tecnologías de matriz, como la hibridación genómica comparativa