Qiagen, 150065, Kit de células individuales REPLI-g WTA (96)

REPLI-g SensiPhi ADN polimerasa, tampones y reactivos para 96 ​​reacciones de amplificación del transcriptoma completo de 60 µl (rendimiento típico: 20 µg)

Características

- Cobertura completa del transcriptoma sólo a partir de células individuales
- WTA uniforme con sesgo de secuencia insignificante debido a la tecnología MDA
- Optimizado para su uso con nuevas tecnologías, incluido NGS
- Amplificación de ARN total o ARN enriquecido con ARNm (poli A+)
- Nueva herramienta para la investigación del cáncer y de células madre

Actuación

Material de muestra (células/ARN total): Área de investigación
Humano/animal: Investigación de biomarcadores (expresión)
Investigación con células madre
Análisis de células fetales circulantes
Estudios de mosaicismo
Estudios de predisposición genética
Tipificación de animales transgénicos
Cáncer: análisis de variantes genéticas somáticas
progresión del tumor
Células madre tumorales/evolución
Análisis de células tumorales circulantes

Cobertura completa del transcriptoma, con baja variabilidad experimental

Un número significativo de lecturas se asignan al ARN codificador de proteínas

Detección confiable de transcripciones de baja abundancia

Para uso en una amplia variedad de aplicaciones y áreas de investigación.

Principio

Todas las enzimas y componentes de amplificación del kit se someten a un procedimiento único y controlado de descontaminación para garantizar la eliminación del ADN o ARN contaminante amplificable por REPLI-g. Tras este proceso, los kits se someten a un riguroso control de calidad para garantizar su completa funcionalidad.
El innovador tampón de lisis estabiliza eficazmente el ARN celular. Esto garantiza que el ARN resultante refleje con precisión el perfil de expresión génica in vivo.
Todos los pasos enzimáticos se han desarrollado específicamente para permitir el procesamiento eficiente del ARN y lograr una amplificación precisa. Por ejemplo, estos procesos incluyen la eliminación eficaz del ADNg antes de la síntesis del ADNc.
La nueva ADN polimerasa REPLI-g SensiPhi se utiliza para la amplificación por desplazamiento múltiple (ADM). Se trata de una enzima de alta afinidad recientemente desarrollada que se une al ADNc con mayor eficiencia, especialmente cuando la concentración de ADNc es baja en la mezcla de reacción. Además, a diferencia de los métodos basados ​​en PCR, la ADN polimerasa REPLI-g SensiPhi posee una potente actividad de corrección de errores que resulta en una reducción de errores 1000 veces mayor. También posee una potente actividad de desplazamiento de cadena, lo que permite la replicación del ADNc mediante estructuras de horquilla estables, resistentes a los procedimientos de amplificación de genoma completo o transcriptoma completo basados ​​en Taq.

Componentes únicos del kit de células individuales REPLI-g WTA

Procedimiento

Lisis celular: una sola muestra celular (que contiene entre 1 y 1000 células) se lisa eficazmente en 5 minutos, sin afectar la integridad del ARN. La muestra lisada se utiliza para la lisis de ARN total (WTA) o, opcionalmente, para el ARN enriquecido con ARNm (poli A+).
Generación de ADNc: tras la lisis celular, el ADNg se elimina antes del proceso de WTA, ya que la medición precisa de los niveles de transcripción depende de la eliminación de resultados falsos positivos causados ​​por la contaminación del ADNg. Dependiendo del cebador seleccionado durante la reacción de transcripción inversa posterior, se amplificarán todas las transcripciones (si se realiza un enriquecimiento total de ARN con cebadores aleatorios y oligo dT) o solo las transcripciones poliadeniladas (si se realiza un enriquecimiento de ARNm poli A+ con cebadores oligo dT). En consecuencia, la reacción contendrá una mezcla de cebadores aleatorios y oligo dT, o solo cebadores oligo dT, lo que reduce la amplificación del ARNr y garantiza la transcripción inversa de los extremos 3' del ADNc (el tamaño de la transcripción es de aproximadamente 700-1000 pb).
Ligación: El ADNc sintetizado se liga mediante una mezcla de ligación de alta eficiencia. Debido a la naturaleza de la reacción de ligación posterior, los fragmentos de ADNc no se ensamblan en el orden en que habrían existido originalmente en la célula. Sin embargo, esto no afecta la detección de secuencias de ácidos nucleicos, como las regiones de empalme, en aplicaciones posteriores como NGS o qPCR.
- Amplificación del transcriptoma completo: el ADNc ligado se amplifica utilizando tecnología MDA, con la nueva ADN polimerasa REPLI-g SensiPhi, en una reacción isotérmica que dura 2 horas.

- El protocolo “Amplificación de las regiones 3' del ARNm (Poli A+) de células individuales” amplifica ARNm (y otros ARN) con colas de poli A+ únicamente y es muy adecuado para una amplia gama de aplicaciones, incluidas NGS (RNA-Seq), PCR en tiempo real y análisis de microarrays.
El protocolo “Amplificación de ARN total a partir de células individuales” amplifica el transcriptoma completo, incluyendo ARN con y sin colas poli A+, ARN lnc y ARN linc. Cabe destacar que el ARNr también se amplifica y estará presente en un alto nivel tras la amplificación. Si se trabaja con sondas específicas de secuencia, como qPCR o arrays, el ARNr amplificado no afectará los resultados de las aplicaciones posteriores. Si se utiliza el ARN amplificado para RNA-Seq, tenga en cuenta que más del 90 % de las lecturas se derivan del ARNr; por lo tanto, se deben obtener suficientes lecturas al realizar la secuenciación del transcriptoma completo.
- El protocolo “Amplificación de ARN purificado” está optimizado para la amplificación del transcriptoma completo a partir de plantillas de ARN total o enriquecido y es muy adecuado para una amplia gama de aplicaciones, incluidas NGS, PCR en tiempo real y análisis de microarrays.

Aplicaciones

- ARNm con colas poli A+
- ARN total
- Todas las regiones de las transcripciones de ARN
- Extremos 3' de los ARNm
- ARN lnc y linc

- ARNt y miARN

El kit REPLI-g WTA Single Cell permite la amplificación uniforme de todos los transcritos a partir de muestras muy pequeñas, representando con precisión el patrón de transcripción de una sola célula con un sesgo de amplificación mínimo o nulo. Según el protocolo, el ADNc amplificado es ideal para su uso en secuenciación de nueva generación (RNA-Seq), matrices de expresión génica o análisis de PCR cuantitativa.

El kit de células individuales REPLI-g WTA se puede utilizar para la amplificación del transcriptoma completo para el análisis de:

No es adecuado para su uso con ácidos nucleicos pequeños (por ejemplo):