Qiagen, 150245, Kit REPLI-g FFPE (100)

ADN polimerasa, tampones y reactivos para reacciones de amplificación del genoma completo de 100 x 50 μl

Características

- Amplificación del genoma completo directamente a partir de secciones de parafina
- Amplificación del genoma completo de ADN purificado a partir de tejido FFPE
- Rendimientos de ADN escalables y estandarizados: hasta 40 µg por sección de tejido
- Protocolo rápido y sencillo para obtener resultados rápidos.

Detalles del producto

La falta de cantidades suficientes de ADN genómico para el análisis genómico puede solucionarse mediante la amplificación global de todo el ADN de una muestra (amplificación del genoma completo). El kit REPLI-g FFPE consta de ADN polimerasa, nuevos tampones y reactivos que permiten una amplificación eficiente del genoma completo a partir de tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) sin necesidad de purificación previa del ADN. Tras la lisis de la sección de tejido, el ADN se procesa para ligar el ADN fragmentado. Las largas cadenas de ADN creadas se amplifican mediante la tecnología REPLI-g de eficacia probada.

Actuación

Para los dos protocolos con diferentes tiempos de amplificación, los rendimientos típicos por reacción de 50 µl con plantillas de calidad estándar son de hasta 10 µg después de 2 horas de amplificación (reacción estándar) y hasta 40 µg después de 8 horas de amplificación (reacción de alto rendimiento).

Principio

La disponibilidad de cantidades suficientes de ADN genómico para el análisis genómico suele ser insuficiente. La amplificación del genoma completo (AGC) supera esta limitación mediante la amplificación global de todo el ADN de una muestra, proporcionando cantidades suficientes para realizar todos los análisis en la misma muestra de ADN.

La genotipificación de muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) permite vincular directamente los cambios morfológicos del tejido con mutaciones genómicas específicas. Sin embargo, la fijación en formalina causa daños irreversibles al ADN, lo que resulta en ADN fragmentado que se entrecruza con otras biomoléculas de la muestra. Además, la cantidad limitada de ADN que se puede extraer de las muestras de tejido FFPE solo es suficiente para unos pocos análisis.

El kit REPLI-g FFPE soluciona estos problemas mediante un procedimiento que implica una novedosa reacción de procesamiento de ADN que prepara y liga el ADN fragmentado (véase la figura "Principio de REPLI-g FFPE"). La amplificación genómica completa de este ADN ligado aleatoriamente se realiza mediante la probada tecnología REPLI-g. Los productos REPLI-g combinan la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) con una ADN polimerasa procesiva única. Gracias a su alta procesividad y actividad de desplazamiento de cadena, la ADN polimerasa REPLI-g minimiza la representación desigual de secuencias y locus. Esto proporciona resultados mucho más fiables en comparación con los métodos WGA basados ​​en PCR. La novedosa reacción de procesamiento de ADN permite extender las ventajas de la MDA a muestras de ADN altamente degradadas derivadas de tejido FFPE. Se puede amplificar material de muestra valioso manteniendo la representación de locus, lo que permite realizar un número ilimitado de análisis posteriores.

Procedimiento

El protocolo REPLI-g FFPE permite la amplificación de ADN purificado a partir de muestras de tejido FFPE o ADN directamente de muestras de tejido FFPE sin purificación previa. Tras la lisis de la sección de tejido, el ADN se procesa utilizando nuevos tampones y enzimas que ligan el ADN fragmentado (véase el diagrama de flujo "Procedimiento REPLI-g FFPE" y la figura "ADN ligado de alto peso molecular"). Las largas cadenas de ADN creadas por la reacción de ligación se amplifican utilizando la tecnología REPLI-g de eficacia probada. Una vez amplificado, el ADN es apto para su uso inmediato en la mayoría de los ensayos de genotipado posteriores sin necesidad de purificación adicional.

El ADN amplificado mediante el procedimiento REPLI-g FFPE es ideal para PCR en tiempo real (p. ej., con los kits QuantiFast) y PCR de punto final (p. ej., con el kit QIAGEN Fast Cycling PCR), con un amplicón de PCR preferiblemente menor que el tamaño promedio del fragmento molde inicial. Otras aplicaciones son el análisis de microsatélites (véase la figura "Análisis fiable de microsatélites") y la genotipificación de SNP (el ADN amplificado mediante REPLI-g FFPE puede no ser adecuado para métodos de genotipificación que requieren digestión con enzimas de restricción para el marcaje del ADN).

Aplicaciones

- PCR en tiempo real
- PCR de punto final
- Genotipado de SNP
- Análisis de microsatélites

El ADN amplificado mediante el procedimiento REPLI-g FFPE es muy adecuado para su uso en: