Qiagen, 150345, Kit de células individuales REPLI-g (96)

REPLI-g sc Polimerasa, tampones y reactivos para 96 ​​reacciones de amplificación del genoma completo (rendimiento de hasta 40 µg/reacción)

Características

- WGA a partir de material de una sola célula con cobertura completa del genoma
- Amplificación imparcial de loci genómicos gracias a la tecnología MDA
- Optimizado para su uso con nuevas tecnologías, incluido NGS
- Rendimientos consistentes de hasta 40 µg (longitud promedio del producto >10 kb)
- Nueva herramienta para la investigación del cáncer, la investigación con células madre o la metagenómica

Detalles del producto

El análisis de secuencias de ADN y la genotipificación de muestras biológicas mediante instrumentación innovadora, como las plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS), suelen verse limitados por la escasa cantidad de muestra disponible. El kit REPLI-g Single Cell está especialmente diseñado para amplificar uniformemente ADN genómico de células individuales (de 1 a <1000 células bacterianas o tumorales) o ADN genómico purificado con una cobertura genómica completa. También existen protocolos adicionales para su uso con sangre fresca o seca, o tejido fresco o congelado. Los tampones y reactivos específicos se someten a un procedimiento de descontaminación único y controlado para evitar la amplificación de ADN contaminante, garantizando resultados altamente fiables en todo momento. La innovadora tecnología de Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA) consigue una amplificación precisa de genomas con un sesgo de secuencia insignificante y sin pérdidas genómicas. A diferencia de las tecnologías de AGL basadas en PCR, la alta fidelidad se incrementa hasta 1000 veces, evitando costosos resultados falsos positivos o negativos.

Actuación

Material de muestra (células/ADN): Área de investigación
Humano/animal: Investigación de biomarcadores (SNP, mutaciones, CNV)
Investigación con células madre
Análisis de células fetales circulantes
Estudios de mosaicismo
Estudios de predisposición genética
Tipificación de animales transgénicos
Cáncer: análisis de variantes genéticas somáticas
progresión del tumor
Células madre tumorales/evolución
Análisis de células tumorales circulantes
Bacterias: Estudios metagenómicos
Análisis de patógenos
Genotipificación microbiana
Plantas*: Investigación de estomas
Análisis de polen

Cobertura completa del genoma, muy adecuada para NGS y otras aplicaciones posteriores

El ADN amplificado con el kit REPLI-g Single Cell tiene una longitud promedio de producto >10 kb y una cobertura genómica maximizada. Se ha probado con numerosos análisis posteriores, incluyendo secuenciación de nueva generación (NGS), hibridación genómica comparativa de arrays (aCGH) y aplicaciones basadas en PCR en tiempo real, y es muy adecuado para ellos (véase la Tabla 2). Al no requerir un paso de amplificación por PCR independiente, la amplificación del genoma completo con REPLI-g y la preparación de la biblioteca requieren menos tiempo de manipulación y generan longitudes de lectura más largas que los métodos basados ​​en PCR (véase la figura "La secuenciación de nueva generación con ADN amplificado con REPLI-g requiere menos tiempo de manipulación y genera más información de secuencia que los métodos basados ​​en PCR"). Se obtienen resultados de NGS comparables de alta calidad, con un alto porcentaje de cobertura de secuencia y tasas de error muy bajas, tanto con ADN genómico purificado como con ADN amplificado con REPLI-g Single Cell, incluso partiendo de una sola célula bacteriana (véase la figura "Resultados de NGS comparables"). Estos hallazgos se ven subrayados por un análisis exhaustivo de una amplia gama de marcadores que cubren todos los cromosomas autosómicos humanos y el cromosoma X, con tres experimentos independientes diferentes que demuestran que el ADN se amplifica con éxito desde todas las áreas del genoma sin una sola pérdida (ver figura “Cobertura completa del genoma”).

El kit de celda única REPLI-g supera a los kits de otros proveedores

Los métodos de amplificación de secuenciación basada en PCR, generalmente utilizados por otros proveedores, generan fragmentos cortos terminados con secuencias de cebadores de PCR que pueden afectar los procesos posteriores (p. ej., secuenciación de nueva generación; véase la figura "La secuenciación de nueva generación con ADN amplificado con REPLI-g requiere menos tiempo de manipulación y genera más información de secuencia que los métodos basados ​​en PCR"). La amplificación de secuenciación basada en PCR puede provocar una amplificación propensa a errores que, por ejemplo, produce mutaciones de un solo par de bases, contracciones y expansiones de STR, y también genera locus sesgados e infrarrepresentados debido al uso de la enzima de baja fidelidad Taq ADN polimerasa. Por el contrario, el kit de células individuales REPLI-g proporciona una amplificación altamente uniforme en todo el genoma, con un sesgo de locus mínimo durante la amplificación. Se analizaron cuatro kits de amplificación de secuenciación (dos con tecnología MDA, incluido el kit de células individuales REPLI-g) y dos con métodos basados ​​en PCR para la representación de secuencias y la pérdida de locus, utilizando los protocolos de amplificación de células individuales específicos de cada kit. A diferencia del kit de células individuales REPLI-g, las células individuales analizadas utilizando kits de otros proveedores a menudo no lograban una representación de secuencia completa e imparcial (ver figura “Amplificación de ADN imparcial de una sola célula”).

Principio

Aplicación: Instrumentación
Secuenciación del genoma completo: Plataformas de secuenciación de próxima generación †
secuenciación del exoma
Matrices de genotipado de SNP: Plataformas de matrices †
Matriz CGH
Tecnologías qPCR/PCR: cicladores de PCR/PCR en tiempo real †
Secuenciación de Sanger: secuenciadores capilares †
Pirosecuenciación: PyroMark (QIAGEN)

El kit REPLI-g Single Cell incluye REPLI-g sc Polimerasa, una formulación optimizada de la innovadora enzima de alta fidelidad Phi 29 polimerasa, para amplificar ADN genómico complejo mediante la tecnología de Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA), junto con una incubación alcalina suave para garantizar una fragmentación del ADN mínima o la generación de sitios abásicos. Está específicamente diseñado para proporcionar altos rendimientos de ADN amplificado a partir de células individuales, como células tumorales aisladas o bacterias (véase la Tabla 1). Además, puede utilizarse con diversas muestras de investigación clínica y no clínica, así como con ADN genómico purificado. Existen protocolos adicionales para su uso con sangre fresca o seca, y tejido fresco o congelado. Los rendimientos típicos de ADN alcanzan constantemente los 40 µg, independientemente de la cantidad inicial de plantilla, lo que significa que los análisis genéticos posteriores pueden realizarse sin necesidad de medir la concentración de ADN. La longitud promedio del producto de más de 10 kb y la cobertura completa del genoma garantizan que el ADN amplificado con el kit de célula única REPLI-g sea muy adecuado para numerosas aplicaciones posteriores, incluidas la secuenciación de próxima generación (NGS), la hibridación genómica comparativa basada en matrices (matriz CGH), la pirosecuenciación y el análisis de PCR en tiempo real (Tabla 2).

Principio de amplificación

El kit REPLI-g Single Cell utiliza amplificación genómica isotérmica, denominada Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA), que implica la unión de hexámeros aleatorios al ADN desnaturalizado, seguida de la síntesis por desplazamiento de cadena a temperatura constante con una forma optimizada de la enzima Phi 29 polimerasa, que posee propiedades de desplazamiento de cadena excepcionalmente fuertes. Se producen eventos de cebado adicionales en cada cadena desplazada que sirven como plantilla, lo que permite la generación de altos rendimientos de ADN amplificado (véase la figura "Tecnología de Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA)"). La Phi 29 polimerasa, una enzima derivada de fagos, es una ADN polimerasa con actividad de exonucleasa de cebado 3'→5' (actividad de corrección) que ofrece una fidelidad hasta 1000 veces mayor en comparación con la ADN polimerasa Taq. Con el exclusivo y optimizado sistema de tampón REPLI-g Single Cell, la polimerasa Phi 29 resuelve fácilmente estructuras secundarias como las horquillas, evitando así el deslizamiento, la interrupción y la disociación de la polimerasa durante la amplificación. Esto permite la generación de fragmentos de ADN de hasta 100 kb sin sesgo de secuencia (véase la figura "Amplificación sin sesgo con la polimerasa Phi 29").

Lisis celular y desnaturalización alcalina del ADN

El ADN genómico debe desnaturalizarse antes de su uso en procedimientos de amplificación enzimática, lo que a menudo se logra mediante métodos agresivos como la incubación a temperaturas elevadas (incubación térmica) o pH elevado (incubación química alcalina). El kit REPLI-g Single Cell utiliza una incubación alcalina suave, lo que permite la lisis celular y la desnaturalización uniforme del ADNg con una fragmentación muy baja o la generación de sitios abásicos. Esto da como resultado un ADN amplificado con una integridad muy alta y maximiza la longitud de los fragmentos amplificados, de modo que los loci y las secuencias genómicas se representan de manera uniforme (véase la figura "Efecto del calor y la desnaturalización alcalina en la representación de loci").

Eliminación eficaz de la contaminación de ADN detectable

Todos los componentes del kit REPLI-g Single Cell se someten a un procedimiento de descontaminación único y controlado para garantizar la eliminación de todo el ADN contaminante amplificable de REPLI-g. Los tampones y reactivos se exponen a la radiación UV mediante un procedimiento innovador y estandarizado para garantizar la ausencia de cualquier residuo detectable de ADN contaminante (véase la figura "Procedimiento de descontaminación innovador"). Tras el tratamiento UV, los kits se someten a un riguroso control de calidad para garantizar su completa funcionalidad.

Procedimiento

Componente del kit: Ventajas
REPLI-g sc Polimerasa: Fragmentos largos de hasta 70 kb
Fidelidad 1000 veces mayor que Taq
Representación de secuencia completa
Amplificación homogénea para todos los loci
Tampón de reacción REPLI-g sc ‡: Optimizado para la amplificación imparcial y la representación de todos los loci
Buffer DLB (lisis y desnaturalización): preparación eficiente para la amplificación
Proceso que no daña el ADN
Procedimiento de descontaminación UV: garantiza la eliminación de la contaminación residual de ADN detectable

Procedimiento sencillo, con un solo tubo

El kit REPLI-g Single Cell utiliza un método sencillo y fiable para lograr una amplificación genómica precisa a partir de células individuales o muestras limitadas. La sencilla configuración de la reacción y el breve tiempo de manipulación de aproximadamente 15 minutos lo convierten en un método sencillo y fiable (véase la figura "Procedimiento del kit REPLI-g Single Cell"). Se han desarrollado tampones y reactivos específicos para obtener altos rendimientos de ADN a partir de células individuales, material tisular limitado y ADN purificado, con una representación completa de la secuencia y una amplificación imparcial (Tabla 3). El ADN amplificado con REPLI-g puede almacenarse a largo plazo a –20 °C sin efectos negativos (véase la figura "Estabilidad constante a largo plazo").

Aplicaciones

- Secuenciación de próxima generación
- Genotipado de SNP con conjuntos de cebadores/sondas TaqMan
- detección de mutaciones basada en qPCR y PCR
- Análisis STR/microsatélites
- Secuenciación de Sanger
- Pirosecuenciación
- Tecnologías de matriz, como la hibridación genómica comparativa (aCGH)

El ADN amplificado con el kit de células individuales REPLI-g se puede utilizar en una variedad de aplicaciones posteriores, que incluyen:

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