Qiagen, 180725, Kit de biblioteca de ARN de células individuales QIAseq UDI-B (96)

Para 96 ​​reacciones: tampones y reactivos para lisis celular, amplificación del transcriptoma completo y preparación de bibliotecas, incluida la fragmentación de ADN, reparación de extremos y ligadura de adaptadores; incluye QIAseq Beads y una placa que contiene 96 adaptadores con código de barras UDI (conjunto B) para usar con instrumentos Illumina
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Características

- Comience con células individuales, poblaciones de células o enriquezca con genomas de ARN pequeños o virus.
- Elija centrarse en los ARNm o explorar el transcriptoma
- La amplificación de ARN REPLI-g y el protocolo sin PCR reducen el sesgo y proporcionan una mayor reproducibilidad
- Los índices duales únicos (incluidos) garantizan datos de alta calidad de NovaSeq y celdas de flujo estampadas
- Bibliotecas listas para secuenciar a partir de células individuales aisladas en solo 5,5 horas

Detalles del producto

El kit QIAseq Single Cell RNA Library Kit UDI es una solución integral para la preparación de bibliotecas de secuenciación de ARN (RNA-seq) de células individuales, poblaciones celulares o pequeñas cantidades de ARN. El kit incluye todos los reactivos necesarios para la lisis celular, la transcripción inversa, la amplificación de ADNc y la preparación de bibliotecas de secuenciación de ARN (NGS) sin PCR, incluyendo QIAseq Beads para la limpieza de la reacción y los kits QIAseq Unique Dual-Index Y-Adapter para la indexación de muestras. Este kit produce bibliotecas de NGS de alta calidad y genera un tubo con ADNc amplificado sobrante que puede almacenarse para experimentos de seguimiento. El kit es ideal para el descubrimiento de transcritos y la expresión génica diferencial de células eucariotas individuales, poblaciones celulares enriquecidas y secuenciación de ARN de muestras limitadas, incluyendo ARN viral.

El kit de biblioteca de ARN de células individuales QIAseq UDI permite a los investigadores centrarse en los ARNm, explorar el transcriptoma (ARNm y ARNlnc) o enriquecer genomas de ARN pequeños (como virus) a partir de muestras de ARN con bajo aporte. Este versátil kit permite múltiples aplicaciones de secuenciación de ARN al elegir entre varios protocolos diferentes incluidos.

Analice datos de ARN-seq con facilidad utilizando el Portal de análisis de ARN-seq integrado en GeneGlobe: una solución de análisis de datos intuitiva basada en la web creada para biólogos e incluida con este kit QIAseq.

Actuación

El kit detecta un mayor número de transcripciones que los métodos de la competencia a cualquier profundidad de secuenciación. En algunos flujos de trabajo de secuenciación de ARN de células individuales, la PCR se utiliza ampliamente tanto para la amplificación de ADNc como para amplificar las pequeñas cantidades de la biblioteca producida. Esto tiene un efecto negativo en la diversidad de la biblioteca debido a la pérdida de transcripciones de baja abundancia debido a efectos estocásticos y sesgo de PCR durante la amplificación de ADNc, así como a la generación de duplicados de PCR durante la amplificación de la biblioteca. Además, estos sistemas de PCR a menudo introducen sesgo de GC y sesgo de longitud, lo que puede dificultar la secuenciación de transcripciones ricas en GC o largas. Por el contrario, el kit de biblioteca de ARN de células individuales QIAseq UDI se basa en la enzima REPLI-g para una reacción de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) altamente eficiente para amplificar el ADNc. Esto genera suficiente material como para que la amplificación de la biblioteca no sea necesaria, lo que proporciona un flujo de trabajo completamente libre de PCR que elimina los duplicados de PCR y maximiza el número de transcripciones detectadas, incluyendo transcripciones largas como los lncRNA.

Principio

Este kit se basa en tres tecnologías clave para permitir la secuenciación de ARN sin PCR a partir de células individuales, poblaciones celulares o ARN de bajo aporte. Tras la lisis celular, la degradación del ADNg y la transcripción inversa, el ADNc se liga para generar una plantilla larga que puede amplificarse mediante una reacción de MDA. Esto se realiza utilizando la ADN polimerasa REPLI-g SensiPhi, que genera cantidades de microgramos de ADNc largo. Este ADNc largo se fragmenta aleatoriamente con la tecnología FX de QIAGEN en insertos cortos aptos para la secuenciación. Finalmente, una preparación de bibliotecas en un solo tubo, altamente optimizada y eficiente, empaqueta estos insertos en bibliotecas de secuenciación de nueva generación (NGS), que pueden secuenciarse directamente, sin necesidad de amplificación de bibliotecas ni sesgo adicional de PCR. En conjunto, la MDA de alto rendimiento, la fragmentación aleatoria e imparcial de FX y la eficiente construcción de bibliotecas en un solo tubo permiten obtener bibliotecas de secuenciación de ARN sin PCR altamente complejas a partir de células individuales en tan solo 5,5 horas.

Procedimiento

El kit QIAseq Single Cell RNA Library Kit UDI es una solución completa de célula a biblioteca que genera bibliotecas de ARN-seq a partir de células eucariotas individuales o de niveles de picogramos de ARN purificado. El kit contiene reactivos para la lisis eficiente de células individuales aisladas o poblaciones de células de plataformas comunes de clasificación o aislamiento celular. Tras la lisis, el ADN genómico se degrada y se realiza la transcripción inversa. Esta reacción puede cebarse utilizando cebadores oligo-dT para enriquecer con ARN poliadenilados, cebadores aleatorios con QIAseq FastSelect para una cobertura completa del transcriptoma sin ARNr, o puede utilizar sus propios cebadores para enriquecer con genomas específicos de ARN pequeño, como un virus, para la secuenciación. Tras la transcripción inversa y la síntesis de la segunda cadena, un paso de ligación genera una plantilla de ADNc larga y bicatenaria que se amplifica mediante MDA utilizando la ADN polimerasa REPLI-g SensiPhi de alta fidelidad y corrección de errores. Esto genera microgramos de ADNc amplificado, algunos de los cuales pueden almacenarse para su uso posterior o para pruebas de confirmación. El ADNc amplificado se fragmenta mediante la reacción de fragmentación enzimática FX de QIAGEN, lo que genera insertos compatibles con las longitudes de lectura de secuenciación habituales. Al modificar las condiciones de fragmentación, se puede modificar el tamaño del inserto según las preferencias individuales. La reacción de amplificación reproducible elimina la necesidad de cuantificar el ADNc antes de la fragmentación. El ADN fragmentado se pule en sus extremos y se somete a una reacción de ligación altamente eficiente con los kits QIAseq Unique Dual-Index Y-Adapter incluidos. No es necesaria la amplificación de la biblioteca mediante PCR, por lo que se evita la producción de duplicados de PCR y se mantiene una alta diversidad de la biblioteca.

Aplicaciones

- Perfil de expresión genética
- Detección de transcripciones de ARNm/ARNlnc
- Genómica y transcriptómica viral