Qiagen, 19048, conjunto de tampones de plásmido EndoFree

Tampones P1, P2, P3, QBT, QC, QN, ER, TE, H2O sin endotoxinas, ARNasa A; para 10 megapreparaciones de plásmidos o 5 gigapreparaciones (sin endotoxinas)

Características

- Se logró menos de <0,04 EU/µg de ADN
- Eliminación integrada de endotoxinas
- Altos rendimientos de ADN plasmídico de alto número de copias
- LyseBlue para una lisis óptima y un rendimiento máximo de ADN

Detalles del producto

Los kits de plásmidos EndoFree permiten la purificación de ADN plasmídico sin endotoxinas mediante intercambio aniónico. Los cartuchos QIAfilter permiten una rápida purificación del lisado mediante filtración. El ADN purificado supera la pureza obtenida por centrifugación en gradiente de CsCl 2x y es adecuado para aplicaciones avanzadas de transfección. El kit de tampón de plásmidos EndoFree puede utilizarse para preparaciones de ADN plasmídico o cósmido de grado transfección de 10 megas o 5 gigas.

El tampón ER de los kits de plásmidos EndoFree se ha actualizado para excluir Triton™ X-114, lo que garantiza el cumplimiento de REACH y niveles de endotoxinas aún más bajos (<0,04 UE/μg) según los estándares de vacunas de la FDA. El tampón mejorado reduce el tiempo de incubación de 30 minutos en hielo a tan solo 5 minutos a temperatura ambiente.*

*Tenga en cuenta: esta actualización incluye volúmenes de Buffer ER ajustados y tiempos de incubación revisados ​​en el protocolo.

Actuación

Método de preparación de plásmidos: Endotoxina (UE † /µg ADN)
Kit de plásmido EndoFree: 0,04
Kit de plásmidos QIAGEN: 9.3
2x CsCl: 2,6
Suspensión de gel de sílice: 1230,0

Método de purificación de ADN: Porcentaje de células transfectadas
Kit de plásmido EndoFree: 21,0 % ± 0,93
Kit de plásmido QIAGEN: 8,1 % ± 0,57
Suspensión de gel de sílice: 5,2 % ± 0,74

Los kits de plásmidos EndoFree integran un eficiente paso de eliminación de endotoxinas en el procedimiento de purificación de plásmidos, sin necesidad de extracciones adicionales ni columnas de afinidad para eliminar lipopolisacáridos. Los lisados ​​bacterianos se clarifican mediante filtración con un cartucho QIAfilter Mega-Giga o Maxi, y el ADN plasmídico se purifica en puntas QIAGEN de flujo por gravedad que contienen resina de intercambio aniónico. Se obtienen rendimientos de hasta 500 μg (maxi), 2,5 mg (mega) y 10 mg (giga) de ADN purificado a partir del cultivo (los volúmenes de cultivo dependen del número de copias del plásmido, el tamaño del inserto, la cepa huésped y el medio de cultivo). El ADN purificado está libre de endotoxinas (<0,04 UE/µg de ADN).

Para la purificación de plásmidos y cósmidos de bajo número de copias, el EndoFree Plasmid Mega Kit es una mejor opción que el EndoFree Giga Plasmid Kit, debido a los grandes volúmenes de cultivo necesarios y la capacidad limitada del cartucho QIAfilter Mega-Giga.

Los kits de plásmidos EndoFree eliminan las endotoxinas bacterianas liberadas durante la lisis e influyen en la transfección del ADN en células primarias y cultivos celulares sensibles. El ADN libre de endotoxinas obtenido con los kits de plásmidos EndoFree es ideal para obtener resultados reproducibles y fiables en la transfección (véanse las figuras "Método de purificación de plásmidos frente a eficiencia de transfección" y "Pureza de plásmidos frente a eficiencia de transfección" y las tablas "Niveles de endotoxinas en preparaciones de plásmidos" y "El ADN EndoFree produce altas eficiencias de transfección con células primarias"). El ADN ultrapuro libre de endotoxinas de QIAGEN también es adecuado para la investigación en terapia génica y otras aplicaciones sensibles.

Principio

Características: EndoFree Plasmid Maxi Kit
Aplicaciones: Investigación en terapia génica, transfección de células sensibles.
Volumen de cultivo/material de partida: 100–250 ml de volumen de cultivo
Tipo de plásmido: ADN cósmido de alto número de copias, de bajo número de copias
Procesamiento: Manual (flujo por gravedad)
Muestra por ejecución: 1 muestra por ejecución
Tiempo por carrera: 125 min
Rendimiento: <500 µg

El nivel de contaminación por endotoxinas en el ADN plasmídico purificado depende del método de purificación utilizado (véase la tabla "Niveles de endotoxinas en preparaciones plasmídicas"). El ADN purificado con sílice en suspensión presenta niveles extremadamente altos de endotoxinas. Los kits de plásmidos QIAGEN, QIAfilter y HiSpeed, junto con la ultracentrifugación con CsCl 2x, producen ADN muy puro con niveles relativamente bajos de endotoxinas. Los kits de plásmidos EndoFree incluyen un paso integrado de eliminación de endotoxinas para obtener ADN plasmídico con <0,04 UE/µg.

Los cartuchos QIAfilter, incluidos en los kits de plásmidos QIAfilter, HiSpeed ​​y EndoFree, son unidades de filtración especiales diseñadas para sustituir la centrifugación tras la lisis alcalina de células bacterianas. Los cartuchos QIAfilter eliminan completamente los precipitados de SDS y purifican los lisados ​​bacterianos en una fracción del tiempo necesario para la centrifugación, lo que reduce el tiempo de purificación de plásmidos hasta en una hora. Los cartuchos QIAfilter Maxi tienen formato de jeringa y los lisados ​​se purifican en cuestión de segundos al empujar el líquido a través del filtro. Los cartuchos QIAfilter Mega-Giga funcionan con vacío doméstico para purificar eficazmente incluso grandes volúmenes de lisado bacteriano con el mínimo esfuerzo (tenga en cuenta que la botella no está incluida en los kits).

La exclusiva resina de intercambio aniónico de las puntas QIAGEN se desarrolló exclusivamente para la purificación de ácidos nucleicos. Sus excepcionales propiedades de separación dan como resultado una pureza del ADN equivalente o superior a la obtenida mediante dos rondas sucesivas de centrifugación en gradiente de CsCl. Las puntas QIAGEN preempaquetadas funcionan por gravedad y nunca se secan, lo que minimiza el tiempo de preparación de plásmidos. Todo el sistema de purificación de plásmidos QIAGEN evita el uso de sustancias tóxicas como fenol, cloroformo, bromuro de etidio y CsCl, minimizando así los riesgos para el usuario y el medio ambiente.

Las endotoxinas, también conocidas como lipopolisacáridos o LPS, son componentes de la membrana celular de bacterias gramnegativas como E. coli (véase la figura "Pared celular bacteriana"). Las endotoxinas se liberan durante la lisis de la purificación de plásmidos y reducen significativamente la eficiencia de la transfección en líneas celulares sensibles a las endotoxinas (véanse las figuras "Método de purificación de plásmidos versus eficiencia de la transfección" y "Pureza del plásmido versus eficiencia de la transfección" y las tablas "Niveles de endotoxinas en preparaciones de plásmidos" y "El ADN EndoFree produce altas eficiencias de transfección con células primarias"). Además, las endotoxinas pueden influir en la captación de ADN plasmídico en experimentos de transfección al competir con el ADN por el reactivo de transfección "libre". Las endotoxinas también inducen la activación inespecífica de respuestas inmunitarias en células inmunitarias como macrófagos y linfocitos B, lo que puede dar lugar a una interpretación errónea de los resultados de la transfección. Estas respuestas incluyen la síntesis inducida de proteínas y lípidos como IL-1 y prostaglandina. En general, las endotoxinas representan una variable incontrolable en la configuración de los experimentos de transfección, lo que influye en el resultado y la reproducibilidad de los resultados, dificultando su comparación e interpretación. En la investigación en terapia génica, las endotoxinas pueden interferir causando el síndrome de shock endotóxico y la activación de la cascada del complemento.

Procedimiento

Las células bacterianas se lisan en condiciones alcalinas y los lisados ​​crudos se clarifican con el cartucho QIAfilter. En esta etapa, se añade el tampón de eliminación de endotoxinas al lisado filtrado, que se incuba en hielo. El lisado clarificado se carga en la punta de intercambio aniónico, donde el ADN plasmídico se une selectivamente en condiciones adecuadas de baja salinidad y pH. El ARN, las proteínas, los metabolitos y otras impurezas de bajo peso molecular se eliminan mediante un lavado con sal media, y el ADN plasmídico ultrapuro se eluye en tampón con alta salinidad (véase el diagrama de flujo "Procedimientos del kit de plásmidos QIAGEN"). El ADN se concentra y desaliniza mediante precipitación con isopropanol y se recoge por centrifugación.

Aplicaciones

- Transfección, incluyendo células primarias, sensibles y en suspensión.
- Investigación en terapia genética
- Silenciamiento genético
- Microinyección

El ADN purificado con los kits de plásmidos EndoFree es adecuado para cualquier aplicación sensible, incluidas: