Qiagen, 201209, Taq ADN polimerasa (25000 U)

100 x 250 unidades de Taq ADN polimerasa, tampón PCR 10x, tampón PCR CoralLoad 10x, solución Q 5x, 25 mM MgCl2

Características

- Elección de formatos para mayor comodidad y facilidad de manejo.
- Tampón PCR QIAGEN para una optimización mínima
- Solución Q para la amplificación de plantillas ricas en GC
- Tampón de PCR adicional listo para cargar para un manejo más rápido

Detalles del producto

La Taq ADN Polimerasa es una polimerasa replicativa derivada de la eubacteria termófila Thermus aquaticus. Su actividad termoestable a temperaturas superiores a 70 °C la hace adecuada para aplicaciones de amplificación por PCR estándar y especializada. La Taq ADN Polimerasa de QIAGEN se suministra con un tampón de PCR especialmente formulado para una configuración rápida con una optimización mínima de los parámetros de PCR, una solución Q para facilitar la amplificación de plantillas difíciles (p. ej., ricas en GC) y la ventaja adicional de ahorro de tiempo del tampón de PCR CoralLoad con dos colorantes de seguimiento de gel para permitir la carga inmediata de los productos de PCR.

La ADN polimerasa Taq de QIAGEN también está disponible en el kit Taq PCR Core, que incluye dNTP. Si prefiere un formato de mezcla maestra, con todos los componentes necesarios, consulte el kit Taq PCR Master Mix.

La fuente de la ADN polimerasa Taq, la eubacteria termófila Thermus aquaticus, se identificó por primera vez en 1966, y vivía y prosperaba a unos 75 °C en las aguas termales del Parque Nacional de Yellowstone. La ADN polimerasa Taq tiene una temperatura óptima de 72 °C y no se desnaturaliza a 95 °C. Esta termoestabilidad intrínseca la hace adecuada para aplicaciones de amplificación por PCR estándar y especializada, gracias a su capacidad fundamental para mantener una actividad catalítica y una estabilidad relativamente altas tras múltiples ciclos de ciclos térmicos a altas temperaturas.

La ADN polimerasa Taq posee actividad exonucleasa 5'→3' para eliminar cebadores de ARN, pero carece de actividad de "corrección" exonucleasa 3'→5'. Muchas ADN polimerasas realizan síntesis de ADN de alta precisión incluso en ausencia de corrección exonucleolítica. En la naturaleza, Thermus aquaticus compensa la falta de corrección con un sistema de reparación de errores de apareamiento (MMR) que incluye un homólogo MutS que desempeña un papel crucial en la corrección de errores de replicación. La ADN polimerasa Taq funciona mejor al amplificar fragmentos de ADN <2 kb, pero puede amplificar fragmentos más largos de manera eficiente bajo condiciones de reacción definidas: concentración de dNTP, pH y concentración de MgCl2 en relación con la concentración total de dNTP presentes. Bajo estas condiciones, se puede lograr una tasa de error para la ADN polimerasa Taq por nucleótido polimerizado a 70 °C tan baja como 10-5 para errores de sustitución de bases y 10-6 para errores de desplazamiento del marco de lectura.

La actividad de transferasa terminal no dependiente de molde, inherente a la ADN polimerasa Taq y otras ADN polimerasas sin corrección de errores, proporciona un método altamente eficiente para clonar productos de PCR. La ADN polimerasa Taq añade un único residuo desapareado, preferentemente un residuo de adenosilo, a cada extremo 3' de un producto amplificado bicatenario (adición de A adicional). Esta propiedad es una ventaja para la estrategia de clonación TA, pero puede presentar inconvenientes cuando se utiliza la ADN polimerasa Taq para el análisis de genotipado de microsatélites.

La ADN polimerasa Taq de QIAGEN está diseñada para ofrecer flujos de trabajo rápidos y confiables relacionados con PCR que se optimizan fácilmente para lograr un rendimiento de amplificación eficiente y tasas de error reducidas.

Si busca una ADN polimerasa con mayor fidelidad o alcance que la Taq ADN polimerasa, explore nuestras enzimas y mezclas de largo alcance o de mayor fidelidad. La PCR de largo alcance proporciona una amplificación de largo alcance altamente sensible y específica de hasta 30 kb utilizando cualquier plantilla de ADN o ADNc. Las enzimas y mezclas maestras de alta fidelidad ofrecen mayor fidelidad, velocidad y rendimiento en comparación con la Taq ADN polimerasa estándar.

Actuación

Características: Especificaciones
Concentración: 5 unidades/µL
Enzima recombinante: Sí
Análogos de sustrato: dNTP, ddNTP, dUTP, biotina-11-dUTP, DIG-11-dUTP, dNTP/ddNTP fluorescente
Velocidad de extensión: 2–4 kb/min a 72 °C
Vida media: 10 min a 97 °C; 60 min a 94 °C
Eficiencia de amplificación: ≥105 veces
Actividad exonucleasa 5'→3': Sí
Adición adicional: Sí
Actividad de corrección de pruebas de la exonucleasa 3'→5': No
Nucleasas contaminantes: No
ARNasas contaminantes: No
Proteasas contaminantes: No
Actividad autocebante: No

La ADN polimerasa Taq supera a los sistemas de enzimas Taq de otros proveedores y ofrece un rendimiento de PCR eficiente, incluso para objetivos con pocas copias, más largos o difíciles, en una amplia gama de condiciones sin necesidad de una optimización que consuma mucho tiempo.

Reproducibilidad lote a lote con objetivos de bajo número de copias.

La especificidad y reproducibilidad de la PCR con la ADN polimerasa Taq de QIAGEN se demostraron al amplificar de forma reproducible una diana con un bajo número de copias a partir de ADN genómico humano mediante tres lotes diferentes de la enzima (véase la figura "Reproducibilidad lote a lote"). Un fragmento del gen de una sola copia de la fibrosis quística se amplificó con tres lotes diferentes de la ADN polimerasa Taq de QIAGEN en condiciones estándar a partir de 30 ng, 3 ng y 300 pg de ADN genómico humano, correspondientes a 10⁻¹, 10⁻¹ y 10⁻² copias de la diana molde, respectivamente. No se observaron diferencias entre los lotes al analizar volúmenes iguales del producto de PCR en un gel de agarosa al 1%.

Amplificación específica de productos de PCR de más de 5 kb.

La ADN polimerasa Taq de QIAGEN con tampón de PCR demostró una mayor capacidad que una enzima de la competencia para amplificar con éxito una diana de más de 5 kb (véase la figura "Amplificación específica de productos de PCR largos"). Se amplificaron tres productos de ADN genómico humano de diferente tamaño en paralelo, utilizando la ADN polimerasa Taq de QIAGEN y tampón de PCR en condiciones estándar, o la ADN polimerasa Taq y tampón de otro proveedor, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados de las amplificaciones de amplicones sucesivamente más largos, analizados en un gel de agarosa al 1%, muestran una disparidad de eficiencia cada vez mayor entre la ADN polimerasa Taq de QIAGEN y la Taq del otro proveedor. Las concentraciones de producto de ambos sistemas fueron similares para un amplicón corto (0,5 kb), mientras que la ADN polimerasa Taq de QIAGEN duplicó su rendimiento con la Taq de la competencia para un amplicón ligeramente más largo (1,5 kb). Se observó una marcada diferencia (aproximadamente 10 veces) entre los dos sistemas enzimáticos cuando la diana tenía una longitud de 7,3 kb.

Amplia ventana de temperatura de recocido (50–60 °C) sin optimización.

La amplificación por PCR con la Taq ADN polimerasa de QIAGEN y el tampón de PCR fue más tolerante a un amplio rango de temperaturas de hibridación que la enzima de otro proveedor. No fue necesaria la optimización de la temperatura de hibridación para garantizar una amplificación eficiente (véase la figura "A. Amplia ventana de temperatura de hibridación"). Se amplificó un fragmento del gen de copia única de la fibrosis quística a partir de ADN genómico humano de forma interna utilizando la Taq ADN polimerasa de QIAGEN y el tampón de PCR en condiciones estándar, o la Taq ADN polimerasa y el tampón de otro proveedor, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las amplificaciones por PCR se realizaron en paralelo sin optimización adicional a temperaturas de hibridación con incrementos de 2 grados entre 50 °C y 60 °C. Se analizaron volúmenes iguales de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%.

Tolerancia a la concentración variable de magnesio (1,5–4,0 mM) sin optimización.

La amplificación por PCR con la Taq ADN polimerasa de QIAGEN y el tampón de PCR fue más tolerante a un amplio rango de concentraciones de iones de magnesio que una enzima de otro proveedor. No fue necesaria la optimización del Mg₂₄ para garantizar una amplificación eficiente (véase la figura "B. Tolerancia a concentraciones variables de magnesio"). Se amplificó un fragmento del gen priónico de copia única a partir de ADN genómico humano de forma interna utilizando la Taq ADN polimerasa de QIAGEN y el tampón de PCR en condiciones estándar, o la Taq ADN polimerasa y el tampón de otro proveedor, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las amplificaciones por PCR se realizaron en paralelo sin optimización adicional, utilizando concentraciones de Mg₂₄ con incrementos de 0,5 mM entre 1,5 mM y 4,0 mM. Se analizaron volúmenes iguales de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%.

Tolerancia de diferentes valores de Tm del cebador (>25 °C) sin optimización.

La amplificación por PCR con Taq ADN polimerasa y tampón de PCR fue tolerante a valores de Tm de pares de cebadores muy diferentes (diferencia de >25 °C). No se requirió la coincidencia de los valores de Tm ni la optimización de la temperatura de annealing para asegurar una amplificación eficiente (ver figura: “Tolerancia de diferentes valores de Tm de cebador”). El gen humano de fibrosis quística de copia única se amplificó en condiciones estándar con Taq ADN polimerasa y tampón de PCR y los mismos cebadores utilizando tres temperaturas de annealing diferentes: 55 °C, 60 °C y 65 °C. Los cebadores empleados fueron un 22mer con una Tm de 57,5 ​​°C (contenido de GC: 54,5 %) y un 32mer con una Tm de 85,2 °C (contenido de GC: 78 %). El análisis del 10 % de cada reacción de 100 µL en un gel de agarosa al 1 % mostró una amplificación consistente y confiable del objetivo en estas condiciones de PCR subóptimas.

Amplificación de plantillas difíciles asistida por Q-Solution.

La solución Q se incluye con la Taq ADN polimerasa y el kit Taq PCR Core. Este reactivo modifica el comportamiento de fusión del ADN y facilita la amplificación de moldes ricos en GC o moldes con un alto grado de estructura secundaria (véase la figura: "Amplificación de moldes difíciles con solución Q"). La amplificación por duplicado se realizó con la Taq ADN polimerasa y el tampón de PCR en ausencia (-) o presencia (+) de solución Q 1x, utilizando dos sistemas de cebador-molde diferentes para (A) el gen del receptor II de angiotensina humano y (B) el gen de la proteína quinasa C de ratón. El análisis de volúmenes iguales de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% mostró claramente la ventaja de añadir solución Q a estas reacciones de PCR.

Envío y almacenamiento.

La ADN polimerasa Taq y el kit Taq PCR Core se envían en hielo seco, pero conservan su actividad completa a temperatura ambiente (15–25 °C) durante 2 semanas.

La Taq ADN polimerasa y el kit Taq PCR Core, incluyendo los tampones y reactivos, deben almacenarse inmediatamente después de su recepción a –20 °C en un congelador a temperatura constante. Si se almacenan en estas condiciones y se manipulan correctamente, estos productos pueden conservarse al menos hasta la fecha de caducidad sin que su rendimiento se vea afectado.

Especificaciones de la enzima Taq ADN polimerasa

Principio

La Taq ADN Polimerasa es una enzima recombinante de alta calidad producida por QIAGEN. Esta enzima es adecuada para PCR rutinaria (p. ej., sondas, análisis de expresión génica y clonación), así como para aplicaciones especializadas de PCR (p. ej., huella genética basada en PCR y visualización diferencial para identificar genes expresados ​​diferencialmente entre dos o más muestras de células o tejidos).

La Taq ADN polimerasa se utiliza para PCR en combinación con el tampón de PCR o el tampón CoralLoad para obtener resultados reproducibles sin necesidad de una optimización laboriosa. Estos tampones de PCR especializados se desarrollaron para ahorrar tiempo y esfuerzo al reducir la necesidad de optimizar los sistemas individuales de cebador-molde. Q-Solution está disponible para facilitar la amplificación de moldes ricos en GC o moldes con un alto grado de estructura secundaria.

Tampón de PCR

El tampón de PCR QIAGEN minimiza la necesidad de optimizar la PCR y ahorra tiempo y esfuerzo al eliminar los pasos adicionales necesarios para establecer una temperatura de annealing ideal o una concentración de Mg₂₄ (véase la figura: "A. Amplia ventana de temperatura de annealing. B. Tolerancia a concentraciones variables de magnesio"). Una combinación equilibrada de KCl y (NH₄)₂SO₄ en el tampón de PCR proporciona condiciones de annealing de cebadores más rigurosas en un rango más amplio de temperaturas y concentraciones de Mg₂₄ que las proporcionadas por los tampones de PCR convencionales. El efecto combinado de los cationes NH₄ y K₅ mantiene una alta proporción de unión específica e inespecífica entre cebador y molde durante el annealing de cada ciclo de PCR (véase la figura: "Los cationes NH₄ y K₅ en el tampón de PCR QIAGEN aumentan el annealing de cebadores específicos").

Tampón de PCR CoralLoad

El tampón de PCR CoralLoad ofrece la misma alta especificidad de PCR y una optimización mínima de la reacción que el tampón de PCR convencional, con dos ventajas adicionales. Para mayor comodidad, el tampón contiene colorantes marcadores naranja y rojo que mejoran la visibilidad del pipeteo y permiten la carga directa de productos de PCR en el gel para estimar la distancia de migración del ADN y optimizar el tiempo de ejecución en el gel de agarosa (véase la figura "Tamaño de PCR CoralLoad").

Solución Q

La solución Q modifica el comportamiento de fusión del ADN. El uso de este reactivo puede mejorar la PCR subóptima y permitir la amplificación de moldes ricos en GC o moldes con un alto grado de estructura secundaria (véase la figura: "Amplificación de moldes difíciles con solución Q"). A diferencia del DMSO y otros aditivos para PCR, la solución Q se utiliza a una concentración de trabajo definida con cualquier sistema cebador-molde y no es tóxica.

Procedimiento

Amplificación por PCR

El protocolo de amplificación por PCR con Taq ADN polimerasa, en combinación con tampón de PCR o CoralLoad PCR, sigue unas directrices sencillas (véase el Manual de PCR Taq). Si bien algunas condiciones óptimas de reacción, como los tiempos de incubación y la cantidad de ADN molde, pueden variar y deben determinarse individualmente, con este sistema se pueden obtener resultados reproducibles sin necesidad de optimizar otros parámetros como la temperatura de hibridación, la concentración de magnesio y los valores de Tm de los cebadores.

Si se utiliza el tampón de PCR CoralLoad, el producto de PCR puede cargarse directamente en un gel de agarosa sin necesidad de añadir previamente un tampón de carga ni colorantes de seguimiento del gel. No se recomienda el uso del tampón de PCR CoralLoad sin una purificación intermedia del producto de PCR si las aplicaciones posteriores requieren mediciones de fluorescencia o absorbancia.

Cuando se utiliza Q-Solution por primera vez en un sistema de cebador-plantilla particular, siempre se deben realizar reacciones paralelas con y sin Q-Solution.

Clonación de TA con productos de PCR generados mediante la ADN polimerasa Taq

La subclonación mediante TA-clonación evita el uso de enzimas de restricción y utiliza la adenina (A) y la timina (T) de diferentes fragmentos de ADN para hibridar y ligarse en presencia de ligasa. La Taq ADN polimerasa añade preferentemente una adenina al extremo 3' de los productos de PCR. Estos insertos amplificados por PCR pueden clonarse en vectores linealizados con salientes de timina 3' complementarios.

Aplicaciones

- PCR de rutina
- RT-PCR
- Clonación por PCR
- Proyección
- Huella digital STR
- Huella VNTR para el diagnóstico de infecciones microbianas
- Huella digital PCR RAPD
- Visualización diferencial

La ADN polimerasa Taq se utiliza para aplicaciones estándar y especializadas, que incluyen: