Qiagen, 204245, Kit de RT-PCR QuantiTect SYBR Green (1000) icono_0368_ls_gen_ecológico-s

Para reacciones de 1000 x 50 µl: 25 ml de 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix, 0,5 ml QuantiTect RT Mix, 20 ml de agua sin ARNasa

Características

- Detección de alta sensibilidad de objetivos con bajo número de copias
- qRT-PCR utilizando sondas específicas de secuencia o SYBR Green
- Cuantificación precisa sobre varios registros de plantilla
- No es necesario optimizar las condiciones de reacción y ciclismo.
- Detección del gen de referencia y hasta 3 dianas en el mismo tubo

Detalles del producto

Los kits de RT-PCR QuantiTect permiten la cuantificación sensible de dianas de ARN mediante PCR en tiempo real de un solo paso utilizando sondas específicas de secuencia o detección con SYBR Green I. Los kits también permiten la cuantificación fiable de hasta 5 dianas de ARN en un solo tubo mediante RT-PCR multiplex en tiempo real de un solo paso. La combinación de un sistema de inicio en caliente y un exclusivo tampón de PCR en la mezcla maestra lista para usar garantiza una qRT-PCR de alta sensibilidad en cualquier termociclador en tiempo real sin necesidad de optimización. La mezcla de dNTP incluye dUTP, lo que permite el tratamiento opcional con UNG. Para mayor comodidad, las mezclas maestras de los kits de RT-PCR QuantiTect de un solo paso se pueden almacenar a 2–8 °C.

Hay dos formatos de kit disponibles para RT-PCR multiplex con sondas específicas de secuencia: el kit QuantiTect Multiplex RT-PCR para cicladores que requieren el colorante ROX para la normalización de la fluorescencia, y el kit QuantiTect Multiplex RT-PCR NoROX para el resto de cicladores. El kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR se suministra con una mezcla de RT optimizada para una transcripción inversa eficiente y sensible con una amplia gama de cantidades de ARN molde.

Actuación

Cantidad de ADNc/ARN: Valor medio de C t (RT-PCR de dos pasos)
100 ng: 24,66
10 ng: 28,15
1 ng: 31,42
0,1 ng: 34,80
0,01 ng: 37,78

La ADN polimerasa HotStarTaq, incluida en los kits de RT-PCR de un solo paso de QuantiTect, aumenta la especificidad de la reacción de PCR al proporcionar el inicio en caliente más riguroso en comparación con otras polimerasas. El kit de RT-PCR QuantiTect SYBR Green contiene una combinación única de transcriptasas inversas que proporciona una síntesis de ADNc eficiente y sensible en una amplia gama de cantidades de ARN molde y permite una cuantificación específica en un amplio rango lineal (véase la figura "Resultados comparables en RT-PCR de un solo paso y de dos pasos").

El kit de RT-PCR QuantiTect Probe incorpora un tampón de RT-PCR exclusivo que promueve una hibridación altamente específica de cebadores y sondas con la plantilla de PCR. La ADN polimerasa HotStarTaq y la composición única del tampón de RT-PCR permiten que el kit de RT-PCR QuantiTect Probe proporcione una cuantificación sensible de dianas de ARN con bajo número de copias, así como una cuantificación precisa en un amplio rango lineal (véase la figura "Alta sensibilidad y eficiencia, y amplio rango dinámico").

La realización de la transcripción inversa y la PCR secuencialmente en el mismo tubo no afecta la sensibilidad, como lo demuestran los valores de CT que son comparables a los logrados en la RT-PCR de dos pasos en tiempo real (véanse las figuras "RT-PCR de un paso con un rendimiento comparable a la RT-PCR de dos pasos – A" y "RT-PCR de un paso con un rendimiento comparable a la RT-PCR de dos pasos – B", y la tabla “RT-PCR de un paso con un rendimiento comparable a la RT-PCR de dos pasos”).

RT-PCR de un solo paso con rendimiento comparable al de la RT-PCR de dos pasos.

La detección sensible de tan solo 10 copias de la secuencia diana (véase la figura "Detección de hasta 10 copias de ARN diana en PCR dúplex") se puede lograr en qRT-PCR multiplex con los kits QuantiTect Multiplex RT-PCR. La cuantificación relativa precisa de la expresión de un gen se logra cuantificando la expresión tanto del gen diana como de un gen de control endógeno en el mismo pocillo o tubo. Con los kits QuantiTect Multiplex RT-PCR, los valores de CT para las dianas en una reacción multiplex son equivalentes a los obtenidos en experimentos de control donde las dianas se amplifican en reacciones separadas (véase la figura "Amplificación comparable en PCR triplex y PCR simplex"). Esto demuestra que las diferentes dianas en la misma reacción multiplex se amplifican de forma eficiente y sensible sin afectarse mutuamente.

Principio

Componente: Características
ADN polimerasa HotStarTaq: activación de 15 min a 95ºC
Tampón RT-PCR QuantiTect SYBR Green: combinación equilibrada de iones NH 4 + y K +
Mezcla de dNTP: incluye dUTP, que reemplaza parcialmente a dTTP y permite el tratamiento UNG opcional de las reacciones.
Colorante SYBR Green I: Produce una fuerte señal fluorescente al unirse al ADN bicatenario.
Colorante ROX: para la normalización de señales fluorescentes en instrumentos Applied Biosystems y, opcionalmente, Agilent
Transcriptasas inversas Omniscript y Sensiscript: mezcla especial de enzimas con alta afinidad por el ARN

Componente: Características
ADN polimerasa HotStarTaq: activación de 15 min a 95ºC
Tampón RT-PCR de sonda QuantiTect: combinación equilibrada de iones NH 4 + y K +
Mezcla de dNTP: incluye dUTP, que reemplaza parcialmente a dTTP y permite el tratamiento UNG opcional de las reacciones.
Colorante SYBR Green I: Produce una fuerte señal fluorescente al unirse al ADN bicatenario.
Colorante ROX: para la normalización de señales fluorescentes en instrumentos Applied Biosystems y, opcionalmente, Agilent
Transcriptasas inversas Omniscript y Sensiscript: mezcla especial de enzimas con alta afinidad por el ARN

Componente: Características
ADN polimerasa HotStarTaq: activación de 15 min a 95ºC
Tampón RT-PCR Multiplex QuantiTect: combinación equilibrada de iones NH 4 + y K +
Factor sintético MP: análisis multiplexado fiable de hasta 4 genes en el mismo tubo
Mezcla de dNTP: incluye dUTP, que reemplaza parcialmente a dTTP y permite el tratamiento UNG opcional de las reacciones.
Colorante ROX*: para la normalización de señales fluorescentes en instrumentos Applied Biosystems y, opcionalmente, Agilent
Transcriptasas inversas Omniscript y Sensiscript: mezcla especial de enzimas con alta afinidad por el ARN

Los kits de RT-PCR QuantiTect contienen una mezcla maestra optimizada y lista para usar que permite la cuantificación en tiempo real, altamente específica y sensible, de dianas de ARN mediante SYBR Green I o sondas específicas de secuencia. El colorante fluorescente SYBR Green I presente en la mezcla maestra de RT-PCR QuantiTect SYBR Green permite el análisis de diversas dianas sin necesidad de sintetizar sondas marcadas específicas para cada diana (véase la tabla «Componentes del kit 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR»).

Componentes del kit RT-PCR 2x QuantiTect SYBR Green

Los kits de RT-PCR QuantiTect Probe contienen una mezcla maestra optimizada y lista para usar que permite la cuantificación en tiempo real, altamente específica y sensible, de dianas de ARN mediante sondas específicas de secuencia (véase la tabla "Componentes del kit 2x QuantiTect Probe RT-PCR"). Los kits están diseñados para su uso con todo tipo de sondas específicas de secuencia, incluyendo sondas de hidrólisis (p. ej., TaqMan® y otras sondas de doble marcado), sondas FRET y balizas moleculares.

Componentes del kit de RT-PCR con 2 sondas QuantiTect

La cuantificación relativa precisa de la expresión de un gen se logra cuantificando la expresión tanto del gen diana como de un gen de control endógeno en el mismo pocillo o tubo. La mezcla maestra optimizada del kit QuantiTect Multiplex RT-PCR garantiza que los productos de PCR en una reacción multiplex se amplifiquen con la misma eficiencia y sensibilidad que los productos de PCR en las reacciones de amplificación única correspondientes (véase la tabla "Componentes del kit 2x QuantiTect Multiplex RT-PCR"). Con el kit, se pueden detectar tan solo 10 copias de un gen diana.

Componentes del kit 2x QuantiTect Multiplex RT-PCR

La combinación equilibrada de iones K+ y NH₄₃ en el tampón de PCR de los kits QuantiTect RT-PCR, junto con el exclusivo factor sintético MP en el tampón QuantiTect Multiplex RT-PCR, promueve la hibridación de cebadores específicos, lo que permite una alta especificidad y sensibilidad de la RT-PCR (véase la figura "Hibridación de cebadores específicos"). Además, una mezcla optimizada de transcriptasas inversas permite la síntesis de ADNc a partir de una amplia gama de cantidades de ARN molde, mientras que la ADN polimerasa HotStarTaq proporciona un arranque en caliente riguroso, lo que previene la formación de productos inespecíficos.

Las mezclas maestras de RT-PCR QuantiTect también contienen dUTP, lo que permite el pretratamiento con uracil-N-glicosilasa (UNG) antes de comenzar la PCR, lo que garantiza que cualquier producto de PCR contaminante no afecte las reacciones de PCR posteriores.

Procedimiento

Tinte ROX: Kit
Se suministra en mezcla maestra: Kit QuantiTect Multiplex RT-PCR
Ausente de la mezcla maestra: Kit QuantiTect Multiplex RT-PCR NR

Los kits de RT-PCR QuantiTect eliminan la necesidad de optimizar las condiciones de reacción, lo cual puede ser tedioso y lento. Simplemente añada los cebadores y el molde a la mezcla maestra de RT-PCR QuantiTect SYBR Green, lista para usar, o los cebadores, la sonda y el molde a la mezcla maestra de RT-PCR QuantiTect Probe, lista para usar, e inicie la reacción (consulte los diagramas de flujo "RT-PCR de un solo paso con SYBR Green" y "RT-PCR de un solo paso con sondas específicas de secuencia"). Siga el protocolo del manual para obtener resultados rápidos y fiables en cualquier termociclador en tiempo real. Si es necesario, las reacciones se pueden pretratar con uracil-N-glicosilasa (UNG) para eliminar el arrastre de productos de PCR de reacciones anteriores.

Se garantizan resultados altamente específicos en el análisis de expresión génica al utilizar los kits de RT-PCR QuantiTect SYBR Green en combinación con los ensayos de cebadores QuantiTect. Estos son conjuntos de cebadores de genoma completo, validados bioinformáticamente, para detectar transcripciones de humanos, ratones, ratas y muchas otras especies. Los ensayos de cebadores QuantiTect pueden solicitarse fácilmente en línea en GeneGlobe.

El manual de los kits QuantiTect Multiplex RT-PCR contiene un protocolo único compatible con todos los termocicladores en tiempo real disponibles y también incluye los colorantes recomendados. Los kits están disponibles con o sin el colorante de referencia pasivo ROX en la mezcla maestra, lo que permite su uso en prácticamente cualquier termociclador en tiempo real (véase la tabla "Elección del kit QuantiTect Multiplex RT-PCR adecuado"). Gracias a las concentraciones optimizadas de ROX, se detectan incluso números bajos de copias mediante el análisis automático de datos.

Cómo elegir el kit QuantiTect Multiplex RT-PCR adecuado

Aplicaciones

Los kits de RT-PCR QuantiTect pueden utilizarse para el análisis de la expresión génica de dianas de ARN en cualquier termociclador en tiempo real, incluyendo instrumentos de Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche y Agilent. Para el Rotor-Gene Q y otros termocicladores Rotor-Gene, recomendamos utilizar el kit de RT-PCR Rotor-Gene Probe, el kit de RT-PCR Rotor-Gene Multiplex o el kit de RT-PCR Rotor-Gene SYBR Green, especialmente desarrollados para el ciclado rápido en estos instrumentos.