Qiagen, 205314, Kit de transcripción QuantiTect Rev. (400)

Para reacciones de 400 x 20 µl: 800 µl de tampón de eliminación de gDNA 7x, 400 µl de transcriptasa inversa Quantiscript, 1,6 ml de tampón RT Quantiscript 5x, 400 µl de mezcla de cebadores RT, 8 x 1,9 ml de agua sin ARNasa

Características

- Síntesis de ADNc y eliminación de ADNg en solo 20 minutos
- Altos rendimientos de ADNc incluso a partir de transcripciones de baja abundancia
- Síntesis de ADNc a partir de las regiones 5' y 3' de las transcripciones
- No es necesario diseñar cebadores o sondas específicos de ARN

Actuación

Valores de CT para IL12A (baja expresión): Valores de CT para IL1RN (alta expresión)
ARN de entrada (ng): QIAGEN
1000: 30.9
100: 34.2
10:37.8
1: ND

Con el kit de transcripción inversa QuantiTect, el ADN genómico contaminante en muestras de ARN se elimina de forma rápida y eficaz gracias al exclusivo tampón de eliminación de ADNg (véase la figura «Eliminación eficaz de ADN genómico para una RT-PCR en tiempo real precisa»). La eliminación del ADN genómico es crucial para obtener resultados precisos de expresión génica, y el diseño de cebadores o sondas específicos para ARN no siempre es posible. Con el tampón de eliminación de ADNg, se ahorra tiempo y costes, ya que no es necesaria una digestión con DNasa por separado, ni durante ni después de la purificación de las muestras de ARN.

La alta afinidad por el ARN de la transcriptasa inversa Quantiscript, en combinación con el tampón RT Quantiscript, permite obtener altos rendimientos de ADNc a partir de cualquier plantilla de ARN (véase la tabla «Mayores rendimientos de ADNc para transcripciones menos abundantes»). Incluso plantillas complejas, como aquellas con alto contenido de GC o estructura secundaria compleja, se transcriben de forma inversa con éxito.

La mezcla de cebadores RT contiene una combinación especialmente optimizada de oligo-dT y cebadores aleatorios que permiten la síntesis de ADNc a partir de todas las regiones de los transcritos de ARN, incluso de las regiones 5' (véase la figura "Detección sensible de una diana en la región 5' de un transcrito de 12,5 kb"). A diferencia de los kits de otros proveedores, el kit de transcripción inversa QuantiTect proporciona una alta producción de ADNc molde para el análisis de PCR en tiempo real, independientemente de la ubicación de la región diana amplificada en el transcrito, y proporciona una mayor sensibilidad en la detección de genes de baja abundancia (véase la figura "Mayor sensibilidad en RT-PCR de dos pasos en tiempo real"). El kit de transcripción inversa QuantiTect también permite una mayor reproducibilidad en la RT-PCR en tiempo real.

Principio

Componente: Beneficios
Tampón de eliminación de gDNA: detección de ARN únicamente en RT-PCR en tiempo real
Transcriptasa inversa Quantiscript: uso de una amplia gama de cantidades de ARN (10 pg a 1 µg de ARN) Alta sensibilidad
Quantiscript RT Buffer: Lectura de plantillas difíciles
RT Primer Mix: síntesis de ADNc de todas las regiones de las transcripciones, incluso de las regiones 5'

La transcriptasa inversa QuantiTect es una novedosa combinación de transcriptasas inversas Omniscript y Sensiscript, con alta afinidad por el ARN y capacidad para sintetizar ADNc a partir de una amplia gama de cantidades de ARN (de 10 pg a 1 µg). A diferencia de los kits de otros proveedores, el kit de transcripción inversa QuantiTect proporciona una alta producción de ADNc molde para el análisis de PCR en tiempo real, independientemente de la ubicación de la región diana amplificada en el transcrito. Incluso moldes complejos, como aquellos con alto contenido de GC o estructura secundaria compleja, se transcriben de forma inversa con éxito. El tampón RT QuantiTect también se ha optimizado para ser compatible con el tampón de PCR en tiempo real.

Para obtener resultados precisos en ensayos de expresión génica mediante RT-PCR en tiempo real, es fundamental amplificar y detectar únicamente ADNc. La interferencia del ADN genómico puede evitarse diseñando cebadores o sondas que abarquen la frontera exón-exón. Sin embargo, si esto no es posible (p. ej., si el ADNc proviene de un gen con un solo exón), es fundamental que la muestra de ARN inicial esté libre de ADN genómico. Con el kit de transcripción inversa QuantiTect, el ADN genómico contaminante de las muestras de ARN se elimina de forma rápida y eficaz gracias a su exclusivo tampón de eliminación de ADNg. Se ahorra tiempo y costes, ya que no se requiere una digestión con DNasa independiente, ni durante ni después de la purificación de las muestras de ARN. Además, no es necesario diseñar cebadores o sondas específicos para el ARN.

Procedimiento

La extracción de ADN genómico y la síntesis de ADNc solo tardan 20 minutos con el kit de transcripción inversa QuantiTect (véase el diagrama de flujo "Síntesis de ADNc rápida y práctica"). El procedimiento es rápido y práctico, ya que ambas reacciones se realizan a la misma temperatura de incubación y se preparan con mezclas maestras.

El kit de transcripción inversa QuantiTect incluye todo lo necesario para una síntesis rápida de ADNc. El ARN purificado se incuba brevemente en tampón de eliminación de ADNg para eliminar eficazmente el ADN genómico contaminante. A diferencia de otros métodos, la muestra de ARN se utiliza directamente en la transcripción inversa, utilizando una mezcla maestra preparada con la transcriptasa inversa Quantiscript, el tampón RT Quantiscript y la mezcla de cebadores RT. Con la transcriptasa inversa Quantiscript, el ARN se puede transcribir a bajas temperaturas, incluso a través de una estructura compleja de 2°, lo que garantiza su integridad. La reacción completa se lleva a cabo a 42 °C y posteriormente se inactiva a 95 °C. No se requieren pasos adicionales para la desnaturalización del ARN, la hibridación de cebadores ni la digestión con ARNasa H.

Aplicaciones

El kit de transcripción inversa QuantiTect permite una RT-PCR en tiempo real altamente eficiente y sensible para todo tipo de material de partida, incluidas muestras microdisecadas con láser y biopsias de tejido.