Qiagen, 210212, Kit de RT-PCR QIAGEN OneStep (100)

Para 100 reacciones de 50 µl: QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix (1 x 200 µl), 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer (1 x 1 ml), dNTP Mix (1 x 200 µl, 10 mM cada uno), 5x Q-Solution (1 x 2 ml), RNase-Free Water (2 x 1,9 ml)

Características

- Configuración rápida y sencilla de un solo tubo
- RT-PCR eficiente en un solo paso de cualquier plantilla de ARN sin optimización
- Mezcla de enzimas única para alta especificidad y sensibilidad.
- Mezcla equilibrada de enzimas con tampón de transcripción inversa optimizado

Principio

Contenido del kit QIAGEN OneStep RT-PCR: Características
ADN polimerasa HotStarTaq: productos altamente específicos
Transcriptasas inversas Sensiscript y Omniscript: Amplio rango de cantidades de ARN (1 pg – 2 µg) Alta sensibilidad
Tampón RT-PCR OneStep: Se necesita una optimización mínima No hay inhibición de la PCR por transcriptasas inversas Inhibición de las ARNasas
Solución Q: facilita la amplificación de plantillas ricas en GC

El kit QIAGEN OneStep RT-PCR está diseñado para una RT-PCR de un solo paso fácil y sensible utilizando cualquier plantilla de ARN.

La mezcla enzimática QIAGEN OneStep RT-PCR contiene una combinación de enzimas especialmente formulada para la transcripción inversa y la PCR. La combinación única de las transcriptasas inversas Omniscript y Sensiscript, con su alta afinidad por los moldes de ARN, garantiza una transcripción altamente eficiente y sensible de cantidades de ARN desde tan solo 1 pg hasta 2 µg. Tras la transcripción inversa, las reacciones se calientan a 95 °C durante 15 minutos para activar la ADN polimerasa HotStarTaq e inactivar simultáneamente las transcriptasas inversas. Este paso de arranque en caliente elimina productos de amplificación inespecíficos, como los dímeros de cebadores, y reduce el smear de fondo, lo que garantiza una RT-PCR altamente sensible y reproducible (véanse las figuras «RT-PCR altamente específica con bajas cantidades de molde» y «Detección eficiente de ARN viral»).

Amplia gama de temperaturas de recocido

La temperatura óptima de hibridación de cebadores depende de la composición de la base (es decir, la proporción de nucleótidos A, T, G y C), la concentración de cebadores y el entorno de reacción iónica. Los tampones de PCR de QIAGEN contienen K+ y NH₄₃ y ofrecen altos rendimientos de producto de PCR específico en un amplio rango de temperaturas de hibridación (véase la figura "Mayor hibridación de cebadores específicos"). Esta especificidad se logra desestabilizando los cebadores unidos de forma inespecífica, lo que proporciona un entorno de reacción más robusto y elimina la necesidad de una tediosa optimización de la temperatura de hibridación. Por el contrario, el rango de temperaturas óptimas de hibridación de PCR es menor y menos predecible utilizando un tampón de PCR o RT-PCR de un solo paso que solo contiene K+ (por ejemplo, los tampones de los proveedores D y T), como se ilustra en la figura "Influencia de la temperatura de hibridación en la especificidad".

El tampón QIAGEN OneStep RT-PCR se ha desarrollado específicamente para permitir una transcripción inversa y una amplificación por PCR eficientes. Contiene aditivos novedosos que previenen la inhibición de la amplificación por PCR por las transcriptasas inversas, un problema frecuente en la RT-PCR de un solo paso. Este tampón garantiza la hibridación específica de cebadores en un amplio rango de temperaturas y concentraciones de Mg₂+, lo que proporciona una RT-PCR robusta y altamente eficiente a partir de cualquier molde de ARN. El kit QIAGEN OneStep RT-PCR incluye Q-Solution, un aditivo innovador que modifica el comportamiento de fusión de los ácidos nucleicos. Q-Solution facilita la transcripción inversa y la amplificación de moldes con un alto contenido de GC o un alto grado de estructura secundaria (véase la figura "RT-PCR de molde rico en GC"). El uso de Q-Solution simplifica la optimización de la RT-PCR para moldes difíciles. El kit QIAGEN OneStep RT-PCR incluye todo lo necesario para una RT-PCR más rápida y sencilla, incluso para las aplicaciones más sensibles (véase la tabla).

Procedimiento

El kit QIAGEN OneStep RT-PCR permite una configuración rápida y sencilla de la RT-PCR. Sea cual sea la aplicación (detección de virus, investigación de diagnóstico molecular o análisis de expresión génica), simplemente mezcle todos los componentes en un tubo e inicie el programa del termociclador (consulte el diagrama de flujo "Procedimiento OneStep RT-PCR"). La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios tanto para la transcripción inversa como para la PCR; no es necesario añadir nada una vez iniciada la reacción (consulte la tabla).

Aplicaciones

- Detección de virus
- RT-PCR de célula única
- Análisis de expresión genética

El kit QIAGEN OneStep RT-PCR es adecuado para aplicaciones de RT-PCR como: