Qiagen, 249910, ensayo personalizado de PCR de LNA QuantiNova (200)

Mezcla de cebadores específicos de ARNm/ARNlnc personalizada en un solo tubo; para 200 reacciones de qPCR o 400 reacciones de dPCR

Características

- Ensayos de alto rendimiento creados con una herramienta de diseño conveniente y el mismo algoritmo utilizado para nuestros ensayos prediseñados
- Ensayos personalizados para adaptarse a su objetivo y necesidad exactos, incluida la detección de nuevas transcripciones o una isoforma específica o variante de empalme
- Capacidad de enviar hasta 10 secuencias y diseñar ensayos para diferenciar o detectar todas las secuencias
- Cebadores cortos mejorados con LNA con alta especificidad y mayor flexibilidad en el posicionamiento del ensayo
- Cuantificación absoluta de cambios de expresión con dPCR utilizando el instrumento QIAcuity y el kit QIAcuity EG PCR

Detalles del producto

Los ensayos personalizados QuantiNova LNA PCR proporcionan un análisis preciso y sensible de la expresión génica de cualquier diana de ARN mediante PCR digital basada en EvaGreen y mejorada con LNA. Nuestro robusto algoritmo de diseño proporciona compatibilidad total con la base de datos Ensembl para dianas humanas, murinas y de rata, y agiliza la creación de ensayos. Los ensayos personalizados son ideales para dianas para las que no existe un ensayo prediseñado, para discriminar variantes de empalme y para verificar nuevos ARNm o lncRNA. Para la PCR digital, hemos optimizado los ensayos con los kits QIAcuity EG PCR y el instrumento QIAcuity, creando un flujo de trabajo de cuantificación absoluta simple y rápido que solo toma 2 horas.

¿Planea utilizar los ensayos personalizados de PCR QuantiNova LNA para análisis de qPCR? Puede encontrar información sobre el producto y su rendimiento en la página del catálogo de qPCR.

¿Necesita un presupuesto para su proyecto de investigación o desea hablar sobre él con nuestro equipo de especialistas? ¡Contáctenos!

Actuación

Análisis de PCR digital optimizado con los kits de PCR QIAcuity EG y el instrumento QIAcuity

Los ensayos de PCR QuantiNova LNA se desarrollaron para proporcionar una amplificación de diana de alta especificidad. Esta puede cuantificarse mediante dos métodos de PCR: qPCR con termocicladores estándar en tiempo real y PCR digital con el instrumento QIAcuity y el kit QIAcuity EG PCR (véase la figura "Uso de los ensayos de PCR QuantiNova LNA para PCR digital"). Tras la síntesis de ADNc con el kit de transcripción inversa QuantiTect, la PCR digital proporciona una cuantificación de la diana altamente precisa, detectando incluso los cambios de expresión más pequeños a las concentraciones más bajas. Un subconjunto de ensayos clave se ha validado experimentalmente con el instrumento QIAcuity.

Ensayos mejorados con LNA altamente sensibles y específicos

Los ensayos personalizados de PCR LNA de QuantiNova se crean utilizando criterios de diseño estrictos y algoritmos validados en laboratorio para brindar la máxima especificidad y eficiencia para obtener resultados de análisis de expresión genética confiables y precisos.

La alta afinidad de unión de las bases de LNA aumenta la flexibilidad de la colocación de cebadores en el transcrito, lo que nos permite usar un posicionamiento inteligente para diseñar ensayos con dianas que de otro modo serían difíciles de analizar. Esto proporciona una mejor discriminación de dianas y una cuantificación robusta y fiable, incluso para dianas ricas en AU, transcripciones de baja abundancia, dianas con alta estructura secundaria y muestras de alta complejidad.

La alta sensibilidad de los ensayos garantiza una excelente eficiencia de amplificación incluso con una sola molécula de ARN, lo que facilita la detección de dianas de baja abundancia, como los lncRNA, a partir de menos material de partida. La mayor especificidad, gracias a la inteligente colocación del LNA, proporciona una alta relación señal-ruido, lo que permite la discriminación de secuencias que difieren en un solo nucleótido y elimina la amplificación inespecífica y la formación de dímeros de cebadores.

Creado utilizando un sofisticado algoritmo de diseño LNA

Veinte años de experiencia en el diseño de LNA nos han permitido desarrollar y optimizar nuestro sofisticado algoritmo de diseño de LNA, que incorpora más de 50 parámetros diferentes, todos ellos validados exhaustivamente en laboratorio según criterios de rendimiento muy estrictos, para garantizar el ensayo más óptimo para la detección exitosa de dianas. Este algoritmo patentado se ha utilizado para diseñar más de 1,3 millones de ensayos y está disponible para sus solicitudes especializadas a través de nuestro práctico generador de ensayos personalizados en GeneGlobe.

Principio

PCR digital basada en EvaGreen

Para una cuantificación absoluta mediante dPCR, utilice los ensayos de PCR QuantiNova LNA junto con el kit de PCR QIAcuity EG, que utiliza detección de fluorescencia basada en EvaGreen. EvaGreen es un colorante intercalante que se une al ADN bicatenario (de forma similar a SYBR® Green) y fluoresce al unirse al ADN. El uso de dPCR basada en EvaGreen ofrece comodidad y ahorro, ya que solo se necesita el conjunto de cebadores para amplificar y detectar el producto. Además, proporciona una mayor resolución en la reacción de dPCR, que se divide en miles de particiones de la nanoplaca de dPCR, por lo que la concentración de cebadores necesaria para la reacción de dPCR es solo la mitad que la de qPCR.

El proceso de diseño personalizado

La herramienta de diseño de ensayos personalizados QuantiNova LNA PCR permite diseñar fácilmente ensayos de PCR mejorados con LNA, altamente sensibles y específicos, para cualquier ARNm o lncRNA no disponible como ensayo prediseñado. Mediante el algoritmo avanzado de diseño de ensayos QuantiNova PCR, se evalúan numerosas combinaciones de ensayos según más de 50 criterios diferentes para encontrar el ensayo óptimo para su diana en cuestión de minutos. La herramienta ha sido diseñada para dianas de ARNm y lncRNA de humanos, ratones y ratas de al menos 55 nucleótidos y blastos, comparadas con las bases de datos relevantes para cada especie, incluyendo Ensembl y RefSeq. Para dianas genéticas conocidas, los ensayos se diseñan de forma predeterminada como ensayos que abarcan intrones, de forma similar a los ensayos prediseñados, para evitar el riesgo de amplificación de ADNg.

Opciones de diseño de ensayos excepcionalmente avanzadas

La herramienta de diseño de ensayos personalizados incluye opciones para crear diseños específicos para cada transcripción, lo que permite discriminar variantes de empalme, SNP o isoformas. También se pueden crear diseños para ensayos comunes a todas las variantes de transcripción. Puede enviar hasta 10 secuencias diana diferentes a la vez y diseñar diez ensayos diferentes, o bien, para transcripciones relacionadas, puede diseñar un ensayo común para todas.

Los ensayos de genes de referencia se pueden combinar fácilmente con los ensayos personalizados

Disponemos de una amplia selección de ensayos de genes de referencia validados funcionalmente en humanos, ratones y ratas para permitir la normalización de datos de alta calidad y garantizar resultados fiables. Estos ensayos se centran en ARN codificantes endógenos, ARN no codificantes largos y pequeñas moléculas de ARN nucleolar que suelen expresarse de forma constitutiva en una amplia variedad de tejidos.

Normalización de los resultados de qPCR de ARNm/ARNlnc

La normalización elimina la variación técnica y biológica entre muestras no relacionada con los cambios biológicos investigados. Una normalización adecuada es crucial para el análisis y la interpretación correctos de los resultados. Normalmente, se utilizan genes de referencia con expresión estable para la normalización.

Generalmente, se recomienda probar varios genes de referencia de control endógenos candidatos antes de configurar el análisis de expresión de ARNm/ARNlnc. Estos candidatos deben seleccionarse entre genes que se espera que se expresen de forma estable en todo el espectro de muestras investigadas. Pueden ser ARNm o ARNlnc con expresión estable, seleccionados con base en la literatura o datos preexistentes (p. ej., análisis de panel mediante NGS o qPCR). El sistema QuantiNova LNA PCR ofrece ensayos de genes de referencia validados para ARN que tienden a expresarse de forma estable y, por lo tanto, son buenos candidatos como genes de referencia.

Todos los genes candidatos de referencia deben validarse empíricamente para cada estudio. Una opción para normalizar el panel de PCR al analizar un gran número de ARNm/ARNlnc es normalizarlo con respecto a la media global (el promedio de todos los ARNm/ARNlnc expresados). Esta opción puede ser adecuada en muestras con una alta tasa de expresión (genes expresados), pero debe utilizarse con precaución en muestras con una baja tasa de expresión. Tampoco es recomendable en muestras con un nivel general de expresión génica modificado. Puede encontrar más información sobre la normalización en el Centro de Análisis de Datos de GeneGlobe.

Análisis de datos de PCR digital

El paquete de software QIAcuity se utiliza para analizar los datos de dPCR e incluye una prueba de expresión genética que proporciona resultados como cambio de pliegue y regulación de pliegue con figuras listas para publicar.

Procedimiento

RT-dPCR de dos pasos

Los mejores resultados se obtienen al realizar la reacción de transcripción inversa con el kit de transcripción inversa QuantiTect (núms. de cat.: 205311, 205313 y 205314). No se recomienda utilizar el kit de transcripción inversa QuantiNova. El ADNc resultante se cuantifica mediante dPCR utilizando las mezclas maestras del kit QIAcuity EG PCR junto con el ensayo de PCR QuantiNova LNA de su elección.

Nota importante: Las cantidades de reacción indicadas entre paréntesis después de los nombres de los productos del ensayo son relevantes para el uso de qPCR. La PCR digital solo requiere la mitad de la concentración de cebadores, pero los volúmenes de reacción son diferentes. Con la placa QIAcuity Nanoplate 26K, puede configurar el mismo número de reacciones que se indica; con la placa Nanoplate 8.5K, puede configurar 3,3 veces más. Consulte el manual de uso de QIAcuity para obtener instrucciones sobre dPCR.

Envío y entrega

Los ensayos PCR QuantiNova LNA se envían a temperatura ambiente. Los ensayos en stock se entregan en un plazo de 1 a 5 días. Durante el periodo de acceso anticipado, se esperan plazos de entrega más largos.

Lo que necesita para comenzar con la PCR digital con el sistema PCR LNA de QuantiNova

Transcripción inversa: Kit de transcripción inversa QuantiTect (núms. de cat.: 205311, 205313, 205314)

Mezcla maestra de dPCR: Kit de PCR QIAcuity EG

Ensayos:

Aplicaciones

- Análisis, perfilado y cuantificación de la expresión de ARNm y ARNlnc
- Validación de datos de expresión génica de RNA-seq
- Perfil de expresión genética
- Análisis de señales y vías
- Confirmación de la supresión de la expresión genética mediante LNA GapmeRs o siRNAs
- Desarrollo de biomarcadores, incluyendo detección, identificación y validación de biomarcadores asociados a enfermedades.
- Seguimiento de cambios fenotípicos relacionados con la expresión genética

Los ensayos personalizados de PCR LNA de QuantiNova son ideales para aplicaciones que incluyen:

También se pueden utilizar múltiples ensayos de PCR LNA QuantiNova para examinar un panel específico de genes.