Qiagen, 249990, ensayo de PCR QuantiNova LNA (200)

Mezcla de cebadores específicos de ARNm/ARNlnc prediseñada en un solo tubo; para 200 reacciones de qPCR o 400 reacciones de dPCR

Características

- Más de 1,3 millones de ensayos proporcionan la cobertura más amplia y mejor de transcripciones de ARNm y lncRNA de humanos, ratones y ratas en Ensembl
- Sensibilidad y especificidad excepcionales utilizando cebadores cortos mejorados con LNA
- Detección precisa en un amplio rango dinámico a partir de 1 copia de ARN
- Optimizado para eliminar la amplificación no específica
- Cuantificación absoluta de cambios de expresión con dPCR utilizando el instrumento QIAcuity y el kit QIAcuity EG PCR

Detalles del producto

Los ensayos QuantiNova LNA PCR están marcando la pauta en el análisis de expresión génica basado en PCR digital. Elija entre la más amplia selección de ensayos prediseñados para una detección precisa y sensible de cualquier ARNm o lncRNA humano, murino o de rata, desde la detección general de transcritos hasta la diferenciación de isoformas específicas de transcritos. La mejora de LNA nos permite diseñar cebadores más cortos, que se posicionan con mayor flexibilidad en la diana. Como resultado, podemos optimizar nuestros diseños para la detección de transcritos específicos o la diferenciación de dianas. Además, la exhaustiva validación del diseño garantiza un rendimiento óptimo y una detección robusta. Para la PCR digital, hemos optimizado los ensayos con los kits QIAcuity EG PCR y el instrumento QIAcuity, creando un flujo de trabajo de cuantificación absoluta simple y rápido que solo toma 2 horas.

¿Planea utilizar los ensayos de PCR QuantiNova LNA para análisis de qPCR? Puede encontrar información específica sobre el producto y su rendimiento en la página del catálogo de qPCR.

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Actuación

Análisis de PCR digital optimizado con los kits de PCR QIAcuity EG y el instrumento QIAcuity

Los ensayos de PCR QuantiNova LNA se desarrollaron para proporcionar una amplificación de diana de alta especificidad. Esta puede cuantificarse mediante dos métodos de PCR: qPCR con termocicladores estándar en tiempo real y PCR digital con el instrumento QIAcuity y el kit QIAcuity EG PCR (véase la figura "Uso de los ensayos de PCR QuantiNova LNA para PCR digital"). Tras la síntesis de ADNc con el kit de transcripción inversa QuantiTect, la PCR digital proporciona una cuantificación de la diana altamente precisa, detectando incluso los cambios de expresión más pequeños a las concentraciones más bajas. Un subconjunto de ensayos clave se ha validado experimentalmente con el instrumento QIAcuity.

LNA mejora el rendimiento de la PCR

Los ensayos de PCR QuantiNova LNA se han desarrollado utilizando estrictos criterios de diseño y algoritmos validados en laboratorio. El riguroso proceso de selección de ensayos garantiza que cada conjunto de cebadores ofrezca la máxima especificidad y eficiencia para obtener resultados fiables y precisos. La normalización de la Tm y la mejora de LNA confieren a los cebadores una mayor afinidad de unión que los cebadores de ADN estándar, lo que aumenta considerablemente la sensibilidad y especificidad del ensayo.

Esta mayor sensibilidad garantiza una excelente eficiencia de amplificación con una sola molécula de ARN, lo que facilita la detección de dianas de baja abundancia, como los lncRNA, a partir de menos material de partida. La mayor especificidad, gracias a la inteligente colocación del LNA, proporciona una alta relación señal-ruido, lo que permite la discriminación de secuencias que difieren en un solo nucleótido y elimina la amplificación inespecífica y la formación de dímeros de cebadores.

La alta afinidad de unión de las bases de LNA aumenta la flexibilidad de la colocación de cebadores en el transcrito, lo que nos permite usar un posicionamiento inteligente para diseñar ensayos con dianas que de otro modo serían difíciles de analizar. Esto proporciona una mejor discriminación de dianas y una cuantificación fiable, incluso para dianas ricas en AU, transcripciones de baja abundancia, dianas con alta estructura secundaria y muestras de alta complejidad.

Confíe en los expertos en diseño de LNA

Veinte años de experiencia en diseño de LNA nos han permitido desarrollar y optimizar nuestro sofisticado algoritmo de diseño de LNA, que incorpora más de 50 parámetros diferentes, todos ellos validados exhaustivamente en laboratorio según criterios de rendimiento muy estrictos, para garantizar el ensayo más óptimo para la detección exitosa de dianas. Hemos seleccionado hasta tres diseños de ensayo diferentes para cada transcripción y hemos validado completamente en laboratorio todos los ensayos de dianas de ARNm y lncRNA más populares. Los ensayos de PCR de LNA QuantiNova simplemente funcionan, sin necesidad de invertir tiempo ni dinero en optimización.

Principio

Ensayos de cobertura genética: ensayos específicos de transcripción
Ensayo recomendado por QIAGEN: Marcado como “Mejor cobertura”
Descripción del diseño y cobertura del ensayo: Cubre la mayoría de las transcripciones biológicamente relevantes del gen dado.
Cuándo elegir: Para la detección general de transcripciones y para determinar si el gen de interés se expresa en una muestra; para la detección de tantas transcripciones e isoformas de un gen como sea posible

- Mejor cobertura: para detección de transcripciones generales
- Mejor ensayo de transcripción: para la detección de una transcripción específica
- Mejor ensayo específico de transcripción: para la diferenciación entre isoformas de transcripción específicas

PCR digital basada en EvaGreen

Para una cuantificación absoluta mediante dPCR, utilice los ensayos de PCR QuantiNova LNA junto con el kit de PCR QIAcuity EG, que utiliza detección de fluorescencia basada en EvaGreen. EvaGreen es un colorante intercalante que se une al ADN bicatenario (de forma similar a SYBR® Green) y fluoresce al unirse al ADN. El uso de dPCR basada en EvaGreen ofrece comodidad y ahorro, ya que solo se necesita el conjunto de cebadores para amplificar y detectar el producto. Además, proporciona una mayor resolución en la reacción de dPCR, que se divide en miles de particiones de la nanoplaca de dPCR, por lo que la concentración de cebadores necesaria para la reacción de dPCR es solo la mitad que la de qPCR.

La cobertura más completa y específica

Nuestro algoritmo patentado se ha utilizado para diseñar más de 1,3 millones de ensayos de PCR QuantiNova LNA, ofreciendo el análisis de ARNm y ARNlnc más sensible, preciso y eficaz. Los ensayos prediseñados abarcan la mayoría de las transcripciones de la base de datos Ensembl para genes humanos, murinos y de rata, lo que permite realizar estudios de expresión génica basados ​​en PCR con la mayor profundidad posible. La mayoría de los ensayos abarcan intrones cuando es posible y solo detectan ARN. Los ensayos que no abarcan un intrón se designan como tales, y si hay un exón en la diana, las señales no deseadas se pueden eliminar fácilmente utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect con el paso integrado de eliminación de ADNg.

Cómo elegir el ensayo adecuado para su objetivo

Los ensayos de PCR LNA QuantiNova prediseñados le permiten detectar con precisión y sensibilidad cualquier ARNm o lncRNA humano, de ratón o de rata, sin importar el nivel de análisis que necesite: detección de transcripción general, detección de una transcripción específica o diferenciación de isoformas de transcripción.

La mayoría de los genes humanos, de ratón y de rata tienen una sola transcripción, pero para aquellos con múltiples transcripciones, seleccionamos hasta tres ensayos por transcripción utilizando el mismo algoritmo. El diseño y la posición de los cebadores de estos ensayos difieren para adaptarse a los diversos requisitos de uso. Nuestra guía de selección de ensayos le ayuda a identificar rápidamente el mejor ensayo de cada categoría. Después de buscar ensayos para su diana, simplemente revise los resultados y busque el ensayo recomendado que se ajuste a su uso previsto:

Consulte la tabla a continuación para obtener más detalles.

Análisis de datos de PCR digital

El paquete de software QIAcuity se utiliza para analizar los datos de dPCR e incluye una prueba de expresión genética que proporciona resultados como cambio de pliegue y regulación de pliegue con figuras listas para publicar.

Ensayos de genes de referencia para cualquier estudio

Disponemos de una amplia selección de ensayos de genes de referencia validados funcionalmente en humanos, ratones y ratas para permitir la normalización de datos de alta calidad y garantizar resultados fiables. Estos ensayos se centran en ARN codificantes endógenos, ARN no codificantes largos y pequeñas moléculas de ARN nucleolar que suelen expresarse de forma constitutiva en una amplia variedad de tejidos.

Normalización de los resultados de qPCR de ARNm/ARNlnc

La normalización elimina la variación técnica y biológica entre muestras no relacionada con los cambios biológicos investigados. Una normalización adecuada es fundamental para el análisis y la interpretación correctos de los resultados de los experimentos de PCR en tiempo real. Normalmente, se utilizan genes de referencia expresados ​​de forma estable para la normalización.

Generalmente, se recomienda probar varios genes de referencia de control endógenos candidatos antes de configurar el análisis de expresión de ARNm/ARNlnc. Estos candidatos deben seleccionarse entre genes que se espera que se expresen de forma estable en todo el espectro de muestras investigadas. Pueden ser ARNm o ARNlnc con expresión estable, seleccionados con base en la literatura o datos preexistentes (p. ej., análisis de panel mediante NGS o qPCR). El sistema QuantiNova LNA PCR ofrece ensayos de genes de referencia validados para ARN que tienden a expresarse de forma estable y, por lo tanto, son buenos candidatos como genes de referencia.

Todos los genes candidatos de referencia deben validarse empíricamente para cada estudio. Una opción para normalizar el panel de PCR al analizar un gran número de ARNm/ARNlnc es normalizarlo con respecto a la media global (el promedio de todos los ARNm/ARNlnc expresados). Esta puede ser una buena opción en muestras con una alta tasa de respuesta (genes expresados), pero debe usarse con precaución en muestras con una baja tasa de respuesta. Tampoco es recomendable en muestras en las que se modifica el nivel general de expresión génica.

Procedimiento

- Ensayos de PCR de LNA QuantiNova
- Ensayos personalizados de PCR de LNA de QuantiNova

RT-dPCR de dos pasos

Los mejores resultados se obtienen al realizar la reacción de transcripción inversa con el kit de transcripción inversa QuantiTect (núms. de cat.: 205311, 205313 y 205314). No se recomienda utilizar el kit de transcripción inversa QuantiNova. El ADNc resultante se cuantifica mediante dPCR utilizando las mezclas maestras del kit QIAcuity EG PCR junto con el ensayo de PCR QuantiNova LNA de su elección.

Nota importante: Las cantidades de reacción indicadas entre paréntesis después de los nombres de los productos del ensayo son relevantes para el uso de qPCR. La PCR digital solo requiere la mitad de la concentración de cebadores, pero los volúmenes de reacción son diferentes. Con la placa QIAcuity Nanoplate 26K, puede configurar el mismo número de reacciones que se indica; con la placa Nanoplate 8.5K, puede configurar hasta 3,3 veces más. Consulte el manual de uso de QIAcuity para obtener instrucciones sobre dPCR.

Envío y entrega

Los ensayos PCR QuantiNova LNA se envían a temperatura ambiente. Los ensayos en stock se entregan en un plazo de 1 a 5 días. Durante el periodo de acceso anticipado, se esperan plazos de entrega más largos.

Lo que necesita para comenzar con la PCR digital con el sistema PCR LNA de QuantiNova

Transcripción inversa: Kit de transcripción inversa QuantiTect (núms. de cat.: 205311, 205313, 205314)

Mezcla maestra de dPCR: Kit de PCR QIAcuity EG

Ensayos:

Aplicaciones

- Análisis, perfilado y cuantificación de la expresión de ARNm y ARNlnc
- Validación de datos de expresión génica de RNA-seq
- Perfil de expresión genética
- Análisis de señales y vías
- Confirmación de la supresión de la expresión genética mediante LNA GapmeRs o siRNAs
- Desarrollo de biomarcadores, incluyendo detección, identificación y validación de biomarcadores asociados a enfermedades.
- Seguimiento de cambios fenotípicos relacionados con la expresión genética

Los ensayos de PCR LNA QuantiNova son muy adecuados para aplicaciones que incluyen: