Qiagen, 250210, ensayo de sonda dPCR CNV

Tubo único que contiene un ensayo específico de genes, listo para usar y concentrado 20x; suficiente para 300/500/1000 reacciones de dPCR de 12 µl cada una

Características

- Más de 200 ensayos validados en laboratorio y una herramienta personalizada para el diseño de ensayos in silico
- La selección de colorante permite la multiplexación de hasta 5 objetivos por reacción
- Ensayos de gen de interés, de referencia y de referencia centromérica disponibles
- Los ensayos listos para usar se han validado para una variedad de muestras, como FFPE, líneas celulares y ADNg.
- Flujo de trabajo de dPCR simple y rápido en QIAcuity
- Cómodo análisis de datos de número de copias mediante el paquete de software QIAcuity

Detalles del producto

Los ensayos de sonda dPCR CNV permiten un análisis específico, preciso, reproducible y fácil de interpretar del cambio en el número de copias para genes individuales o regiones de interés. Los ensayos para más de 200 dianas han sido validados por PCR en laboratorio y se indican como tales en la descripción del ensayo.

Además, está disponible una herramienta de diseño personalizado para abordar las necesidades de ensayo fuera de la oferta de ensayo validada en laboratorio.

Los ensayos de sonda dPCR CNV están disponibles en formato de tubo, listos para usar y con una concentración 20x. El tubo contiene el par de cebadores y una sonda de hidrólisis para su uso con el kit de PCR de sonda QIAcuity (dianas de ADN), el sistema de PCR digital QIAcuity y las nanoplacas QIAcuity.

Cada ensayo permite elegir entre cinco sondas de hidrólisis (fluoróforos) diferentes: FAM, HEX, ROX, Atto 550 y Cy5. Esta flexibilidad permite combinar ensayos para el análisis multiplex de hasta cinco dianas en una sola reacción de dPCR.

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Actuación

Excelente rendimiento de ensayo

Los ensayos de sonda de CNV de dPCR muestran una excelente amplificación del producto y separación entre los grupos de partición negativos y positivos en un análisis dúplex con dos concentraciones diferentes de ADNg molde (véanse los diagramas de dispersión 1D y 2D de las reacciones dúplex para los ensayos de KRAS y TERT). Los resultados indican que se puede realizar un análisis preciso de CNV incluso con bajas concentraciones de ADNg de entrada. Para conocer las cantidades mínimas y máximas de carga en nanoplacas de 85000, consulte la extensión del manual de usuario de QIAcuity.

Análisis preciso y reproducible del número de copias mediante PCR digital

El sistema QIAcuity dPCR, altamente reproducible, y los ensayos de sonda dPCR CNV permiten el análisis de CNV sin necesidad de réplicas, lo que aumenta el rendimiento de las muestras de forma rentable. El análisis dúplex de una muestra de ADNg arrojó el número esperado de copias por genoma para todas las réplicas (véase Análisis preciso y reproducible del número de copias en una reacción dúplex). En una prueba de precisión que analiza una serie de diluciones de ADNg, los ensayos muestran una excelente distribución lineal y separación de grupos (véase Distribución lineal en una prueba de precisión de series de diluciones).

Análisis del número de copias multiplex mediante dPCR

El análisis multiplex con los ensayos de sonda dPCR CNV aumenta el rendimiento y reduce significativamente los costes de análisis por diana. La posibilidad de solicitar estos ensayos con diferentes colorantes (FAM, HEX, ROX, Atto 550 y Cy5) permite un diseño experimental flexible y el análisis multiplex de hasta 5 dianas simultáneamente en una sola reacción. Los ensayos de sonda dPCR CNV muestran una excelente amplificación y separación de grupos positivos y negativos para 5 ensayos multiplexados en una sola reacción (véase detección de CNV en una reacción de 5 plexos).

Principio

Todos los ensayos de sonda dPCR CNV están diseñados para regiones específicas del genoma humano. Los ensayos de sonda dPCR CNV para genes de interés se centran en genes de cáncer y relacionados con el cáncer ampliamente estudiados. Los ensayos de referencia de sonda dPCR CNV y los ensayos de referencia centromérica de sonda dPCR CNV incluyen diversas referencias con diferentes números de copias por genoma, lo que permite seleccionar las referencias de normalización óptimas para cada análisis. Dependiendo de las condiciones experimentales, se pueden incluir múltiples ensayos de GOI y de referencia en las reacciones para calcular con precisión el número de copias del gen o diana de interés.

Los ensayos de sonda de número de copias de dPCR están listos para usar: simplemente añada las mezclas de ensayo individuales a la muestra de ADN y a la mezcla maestra del kit de sonda PCR QIAcuity, cárguelas en la nanoplaca QIAcuity e inicie la ejecución en el instrumento QIAcuity. Cada ensayo se basa en la amplificación por PCR de punto final de una región específica de genes del genoma humano. El producto amplificado se detecta mediante sondas de hidrólisis fluorescentes específicas para la diana, lo que garantiza una alta especificidad del ensayo.

Aquí se describe el principio de la reacción dPCR en las nanoplacas.

Procedimiento

El procedimiento de configuración experimental es sencillo y directo, y puede realizarse en cualquier laboratorio que utilice el instrumento QIAcuity dPCR. Para un análisis más preciso del número de copias, recomendamos realizar una digestión con enzimas de restricción tras el aislamiento del ADN genómico de la muestra. Esta digestión no es necesaria para ADN altamente fragmentado (p. ej., ADN FFPE o ADN circulante) ni ADNc. Para realizar la digestión con enzimas de restricción directamente en la mezcla de reacción, incluya la enzima de restricción recomendada durante la configuración de la reacción. Es fundamental evitar el uso de enzimas de restricción que corten dentro de la región del amplicón diana.

La plantilla fragmentada se mezcla con la mezcla maestra del kit QIAcuity Probe PCR, lista para usar, y el ensayo de sonda dPCR CNV. Esta mezcla se alicuota en cada pocillo de la preplaca de dPCR. La mezcla de reacción se mezcla bien mediante pipeteo y se transfiere a los pocillos de una nanoplaca QIAcuity. Cada gen o diana de interés y cada ensayo de referencia se pueden analizar en un solo pocillo en una reacción multiplex, combinándolos con diferentes fluoróforos.

Tras cargar y sellar la nanoplaca, se ejecuta el programa de ciclado recomendado en el instrumento QIAcuity. Las copias por microlitro resultantes se muestran en el tipo de análisis de cuantificación absoluta del paquete de software QIAcuity. Para calcular el número de copias por genoma, seleccione el tipo de análisis de datos de número de copias en el paquete de software QIAcuity y defina los pocillos de la nanoplaca para el gen/región de interés o la referencia de normalización. Según el protocolo de ciclado, los resultados de la dPCR se pueden analizar en el paquete de software QIAcuity después de unas 2 horas.

Aplicaciones

Los ensayos de sonda dPCR CNV son muy adecuados para detectar con precisión alteraciones o variaciones en el número de copias en loci individuales utilizando ADN de muestras frescas, congeladas o fijadas.