Qiagen, 31014, Columnas de giro Ni-NTA (50)

50 columnas de centrifugación Ni-NTA, tubos de recolección

Características

- Hasta 300 μg de proteína marcada con His por columna en tan solo 15 minutos
- Purificación en condiciones nativas y desnaturalizantes
- Hasta un 95% de homogeneidad en un solo paso
- Columnas de centrifugación listas para usar para un procesamiento rápido, automatizado o manual

Detalles del producto

La sílice Ni-NTA combina Ni-NTA con un material de soporte de sílice macroporoso optimizado para suprimir interacciones hidrofóbicas inespecíficas. Las columnas de centrifugación Ni-NTA (columnas de centrifugación para la purificación de proteínas His) del kit de centrifugación Ni-NTA, disponibles por separado, proporcionan sílice Ni-NTA en un práctico formato de microcentrifugación para facilitar la preparación de múltiples muestras en paralelo. Ofrecen un método sencillo para el cribado funcional de proteínas modificadas, la selección de clones que expresan productos de traducción de longitud completa y la comparación de los niveles de expresión. Cada columna de centrifugación puede purificar hasta 300 µg de proteína marcada con His. Al igual que todas las matrices Ni-NTA, las columnas de centrifugación Ni-NTA pueden utilizarse para la purificación de proteínas en un solo paso en condiciones nativas o desnaturalizadas. El kit de centrifugación Ni-NTA es un kit completo para la purificación por centrifugación de proteínas marcadas con His. Puede automatizarse en QIAcube Connect (véase la imagen "QIAcube Connect").

Actuación

Las columnas de centrifugación Ni-NTA (columnas de centrifugación para purificación de proteína His), también incluidas en el kit de centrifugación Ni-NTA, permiten una purificación automatizada rápida y reproducible (ver figura “Purificación automatizada reproducible”) en diferentes niveles de expresión (ver figura “Purificación en diferentes niveles de expresión”).

Principio

El sistema de purificación de proteínas QIA express Ni-NTA, que incluye las columnas de centrifugación Ni-NTA y el kit de centrifugación Ni-NTA, se basa en la notable selectividad de la resina patentada Ni-NTA (ácido nitrilotriacético de níquel) para proteínas que contienen una etiqueta de afinidad de seis o más residuos de histidina: la etiqueta His. Esta tecnología permite la purificación en un solo paso de prácticamente cualquier proteína marcada con His de cualquier sistema de expresión, tanto en condiciones nativas como desnaturalizadas. El NTA, que cuenta con cuatro sitios de quelación para iones de níquel, se une al níquel con mayor fuerza que los sistemas de purificación quelantes de metales, que solo disponen de tres sitios disponibles para la interacción con iones metálicos. El sitio de quelación adicional evita la lixiviación de iones de níquel y produce una mayor capacidad de unión y preparaciones de proteínas de mayor pureza que las obtenidas con otros sistemas de purificación quelantes de metales. El sistema QIA express puede utilizarse para purificar proteínas marcadas con His de cualquier sistema de expresión, incluyendo baculovirus, células de mamíferos, levaduras y bacterias.

Procedimiento

- 6 M de clorhidrato de guanidina
- 8 M de urea
- 2% Tritón X-100
- 2% Preadolescentes de 20 años
- 1% CHAPS
- 20 mM de β-ME
- 10 mM de DTT
- 50% glicerol
- 20% de etanol
- 2 M de NaCl
- 4 M de MgCl2
- 5 mM de CaCl2
- ≤20 mM de imidazol
- 20 mM de TCEP

La purificación de proteínas marcadas con His consta de 4 pasos: lisis celular, unión, lavado y elución (véase la figura “Purificación en columna de centrifugación Ni-NTA con el sistema de purificación de proteínas Ni-NTA”). La purificación de proteínas recombinantes mediante el sistema QIA express no depende de la estructura tridimensional de la proteína ni de la etiqueta His. Esto permite la purificación de proteínas en un solo paso, ya sea en condiciones nativas o desnaturalizantes, a partir de soluciones diluidas y lisados ​​crudos. Se cargan hasta 600 μl de un lisado celular en una columna de centrifugación Ni-NTA. Una centrifugación rápida de 2 minutos une la proteína marcada a la sílice Ni-NTA, mientras que la mayoría de las proteínas no marcadas fluyen a través de ella. Después de un paso de lavado, la proteína purificada se eluye en condiciones suaves (como la reducción del pH a 5,9 o la adición de 100-500 mM de imidazol) en un volumen de 100-300 μl. La eliminación de la etiqueta His suele ser innecesaria, ya que es pequeña y rara vez inmunogénica. La proteína purificada está lista para su uso inmediato. Las proteínas se pueden purificar a partir de múltiples cultivos de expresión a pequeña escala en unos 30 minutos (procedimiento manual) o aproximadamente 60 minutos (procedimiento automatizado QIAcube Connect). Se pueden utilizar desnaturalizantes y detergentes potentes para una solubilización y purificación eficientes de receptores, proteínas de membrana y proteínas que forman cuerpos de inclusión. Se pueden incluir reactivos que permitan la eliminación eficiente de contaminantes de unión inespecífica en los tampones de lavado (véase la tabla). Las proteínas purificadas se eluyen en condiciones suaves añadiendo 100-250 mM de imidazol como competidor o reduciendo el pH.

Reactivos compatibles con la interacción Ni-NTA–His:

Los reactivos enumerados se han utilizado con éxito en concentraciones hasta las indicadas.

Aplicaciones

- Investigaciones estructurales y funcionales
- Cristalización para la determinación de la estructura tridimensional
- Ensayos que involucran interacción proteína-proteína y proteína-ADN
- Inmunización para producir anticuerpos

El sistema de purificación de proteínas Ni-NTA QIA express, que incluye columnas de centrifugación Ni-NTA y el kit de centrifugación Ni-NTA, proporciona una purificación confiable en un solo paso de proteínas adecuadas para cualquier aplicación, incluidas: