Qiagen, 331535, biblioteca de miRNA QIAseq, aditivos de control de calidad

Anteriormente Exiseq NGS Spike-In Kit n.° 800100. 52 kits de control de calidad de biblioteca QIAseq miRNA, suficientes para hasta 500 muestras; agua sin nucleasas

Características

- Control de calidad de muestras único basado en qPCR de muestras de miRNA/ARN pequeño antes de NGS
- Esencial para muestras desafiantes con bajo contenido de ARN, como los biofluidos.
- Ensayos de PCR de miRNA de LNA en paneles de PCR listos para usar
- Compatible con todos los principales instrumentos qPCR
- Conjunto completo de 52 suplementos de ARN que abarcan una amplia gama de concentraciones
- Evaluación exhaustiva posterior a la secuenciación de la linealidad y reproducibilidad de NGS

Detalles del producto

Los ensayos y arrays de PCR de control de calidad (QC) de la biblioteca de miRNA QIAseq permiten un riguroso control de calidad, tanto de la calidad de las muestras antes de la preparación de la biblioteca NGS como del rendimiento de la NGS tras la secuenciación. La amplificación de los QC Spike-ins de la biblioteca de miRNA QIAseq (un conjunto completo de spike-ins añadidos durante el aislamiento del ARN o al ARN aislado) permite evaluar la reproducibilidad y linealidad de las lecturas NGS asignadas a estas secuencias exógenas, garantizando resultados óptimos de secuenciación de miRNA.

Los kits de biblioteca de miRNA QIAseq se recomiendan para la construcción de bibliotecas sin gel de miRNA, piRNA y ARN pequeño en instrumentos NGS de Illumina y Thermo Fisher Scientific.

Principio

Kit de panel de PCR de control de calidad de la biblioteca de miRNA QIAseq: Inyecciones adicionales de control de calidad de la biblioteca de miRNA QIAseq
Compatible con muestras de biofluidos: ✓
Compatible con células/tejidos: —
Evaluar el rendimiento del ARN: ✓
Evaluar la calidad de miRNA/ARN pequeño: ✓
Evaluar la calidad de la biblioteca: ✓
Evaluar la reproducibilidad de NGS: ✓
Evaluar valores técnicos atípicos: ✓

Procedimiento

Identificación de muestras atípicas: Calcule el delta CT para UniSp100 y UniSp101. El valor típico de CT para UniSp100 se encuentra entre 31 y 34, y para UniSp101, entre 25 y 28. El delta CT para las dos muestras añadidas debe estar entre 5 y 7. Al comparar diferentes muestras, la diferencia de CT entre los análisis debe ser inferior a 0.5.
Evaluación de la síntesis de ADNc: Evalúe la UniSp6 en todas las muestras. El valor debe ser <2 CT s entre dos muestras cualesquiera.
- Evaluación de la hemólisis (para la identificación de biomarcadores séricos/plasmáticos): El valor delta CT (miR-23a – miR-451a) debe ser inferior a 5 para muestras de alta calidad. Un valor de 5 a 7 se considera una muestra dudosa. No se deben utilizar muestras con un valor >7.

Si utiliza el kit de biblioteca de miRNA QIAseq, acceda al Centro de Análisis de Datos GeneGlobe y configure el sitio de análisis para el análisis primario del kit de biblioteca de miRNA QIAseq. Simplemente cargue su archivo FASTQ y configure "QIAseq Spike-in Added" como Sí.
Si utiliza su propio flujo de análisis de datos NGS, las lecturas deben mapearse a las secuencias de inducción de QIAseq NGS (mediante Bowtie2 o un algoritmo de mapeo similar) y deben filtrarse del resto de los datos. Recomendamos usar la configuración de "coincidencia perfecta" al mapear, filtrar y contar las lecturas de inducción de QIAseq NGS en un conjunto de datos (archivos FASTQ). Tras el conteo de las lecturas de inducción de QIAseq NGS, estas deben normalizarse al número total de lecturas por muestra.
Tras realizar esta simple normalización a las lecturas de cada muestra para todas las muestras añadidas, se deben graficar las matrices de correlación para todas las comparaciones entre muestras. Esto se realiza para evaluar la correlación entre muestras en el conjunto de muestras. La correlación esperada debe ser un R² de 0,95-0,99. Al comparar la correlación diaria, esta suele ser menor que la de un lote de muestras purificadas el mismo día. Si las muestras se desvían de estos valores, podrían ser valores atípicos técnicos y deberían excluirse del análisis posterior.

La adición de QIAseq miRNA Library QC Spike-Ins durante el aislamiento de ARN permite monitorear la comparabilidad y reproducibilidad de todo el proceso desde el aislamiento de ARN hasta el análisis de datos NGS.

Los QIAseq miRNA Library QC Spike-Ins también pueden añadirse directamente a las muestras de ARN antes de la preparación de la biblioteca de ARN pequeño. Para obtener proporciones más precisas de los spike-ins frente a los miRNA endógenos en otros tipos de muestras o al utilizar muestras de ARN aisladas, se recomienda la titulación experimental de los QIAseq miRNA Library QC Spike-Ins.

El protocolo consta de 5 pasos:

1. Adición de 52 QIAseq miRNA Library QC Spike-Ins a las muestras durante el aislamiento del ARN

2. Síntesis de ADNc, incluido UniSp6 Spike-In

3. Reacciones de qPCR

4. Evaluación de muestras y NGS de muestras aceptadas

5. Evaluación de los datos de QIAseq miRNA Library QC Spike-Ins

Análisis e interpretación de datos

Los controles QC Spike-In de la biblioteca QIAseq miRNA le permiten supervisar la calidad técnica del aislamiento de ARN y la síntesis de ADNc y la presencia de inhibidores de PCR en la muestra.

Interpretación NGS:

El centro de análisis de datos GeneGlobe para los kits de bibliotecas de miRNA QIAseq alineará automáticamente e informará sobre los picos de miRNA QIAseq además del pequeño/miRNA/piRNA alineado de su muestra.

Interpretación del panel y ensayo de qPCR:

Análisis NGS: