Qiagen, 333002, Panel de ARN dirigido QIAseq (12)

Kit que contiene ensayos y reactivos verificados en laboratorio para síntesis de primera cadena, codificación molecular, amplificación específica de genes y preparación de bibliotecas para secuenciación de ARN dirigida.

Características

- Los códigos de barras moleculares eliminan el sesgo de PCR y de construcción de bibliotecas
- Comience con sólo 25 ng de ARN total
- Flujo de trabajo sencillo para la construcción de una biblioteca en un día
- Úselo con cualquier instrumento Illumina o Thermo-Fisher NGS

Detalles del producto

Los paneles de ARN dirigidos QIAseq se han desarrollado como una solución integral para la caracterización cuantitativa de la expresión génica mediante RNAseq. Estos paneles integran índices moleculares únicos (UMI) y una preparación de bibliotecas basada en PCR en dos etapas para ofrecer una cuantificación imparcial y precisa a partir de muestras humanas, de ratón y de rata. Los paneles dirigidos QIAseq se verifican en laboratorio para garantizar la máxima calidad de los resultados.

Los índices de ARN dirigido QIAseq sirven para indexar muestras para la secuenciación de ARN dirigido y los cebadores necesarios para secuenciar bibliotecas de ARN generadas por los paneles de ARN dirigido QIAseq.

Actuación

- Precisión: los innovadores UMI (índices moleculares únicos) eliminan la duplicación de PCR y el sesgo de amplificación para ofrecer los resultados más precisos (ver figura Cuantificación genética imparcial y precisa).
- Especificidad: La combinación única de nuestro algoritmo de diseño de cebadores patentado y las pruebas rigurosas de cada ensayo de cebadores garantizan una alta especificidad y resultados precisos (ver figura El diseño de cebadores patentado proporciona amplicones específicos de genes: 97 % de especificidad).
Uniformidad: El flujo de trabajo del panel de ARN dirigido QIAseq se ha optimizado para ofrecer resultados de secuenciación altamente uniformes, garantizando así un uso eficiente de la capacidad de secuenciación. De hecho, los UMI (índices moleculares únicos) eliminan por completo el sesgo de PCR en el recuento de RNAseq (véase la figura). Uniformidad inigualable: el 97 % de los ensayos se encuentran dentro del 20 % de la mediana de recuentos de marcadores moleculares.
- Reproducibilidad: El sistema QIAseq Targeted RNA Panel demuestra fuertes correlaciones entre réplicas técnicas, lotes de productos e instrumentos con coeficientes de correlación que promedian por encima de >0,99, para garantizar una detección confiable de diferencias en la expresión entre muestras biológicas.
Sensibilidad: La secuenciación dirigida de ARN mediante UMI está optimizada para ofrecer una cuantificación altamente fiable de hasta ~100 copias de un ARN diana en 25 ng de ARN total (véase la figura. Resultados positivos con tan solo 0,2 copias de ARN por célula). Los protocolos de bajo consumo permiten a los investigadores comenzar con cantidades menores de ARN en volúmenes más pequeños.
- Flexibilidad: los paneles de ARN dirigidos QIAseq combinan la potencia de NGS con la precisión de qPCR para permitir la multiplexación de varias muestras por NGS al tiempo que ofrecen resultados rentables (consulte la figura Procedimiento simple).

Principio

Los métodos tradicionales de secuenciación de ARN presentan sesgos de duplicación y amplificación por PCR, lo que resulta en un análisis impreciso de la expresión génica. Al introducir UMI (índices moleculares únicos) antes de cualquier amplificación, los paneles de ARN dirigidos QIAseq eliminan este problema y ofrecen una cuantificación génica precisa y digital (véase la figura «Cuantificación génica precisa e imparcial»).

Una característica única de los paneles de ARN dirigidos QIAseq es el conjunto de ensayos de control integrados. Los ensayos de ADNg controlan cualquier contaminación de ADNg en la muestra de ARN para garantizar resultados reproducibles. Los ensayos de genes constitutivos (HKG) se utilizan para normalizar los datos, lo que permite realizar comparaciones entre muestras y entre análisis.

Procedimiento

El flujo de trabajo del QIAseq Targeted RNA Panel comienza con la conversión del ARN total en ADNc (ver figura Procedimiento simple). El flujo de trabajo requiere una entrada mínima de ARN: se pueden usar tan solo 25 ng de ARN total. No se necesitan pasos de enriquecimiento ni depleción de ARNr. El paso de indexación molecular utiliza un cebador específico del gen (GSP1) que contiene un UMI de 12 bases en un panel de cebadores multiplex (dirigido a 12-1000 genes). Después del paso de indexación molecular, el ADNc con etiqueta única se purifica con perlas para eliminar los cebadores residuales, y se configura una PCR con un segundo grupo de cebadores adaptadores específicos del gen (GSP2) y el cebador RS2, que se ceba a partir de una etiqueta común en los cebadores GSP1. Esta reacción asegura que los objetivos previstos se enriquezcan lo suficiente como para estar representados en la biblioteca final. El número de ciclos se mantiene al mínimo para minimizar las variaciones en la amplificación inducidas por PCR (cualquier variación se corrige y se contabiliza fácilmente con los UMI). Se realiza otra limpieza rápida con microesferas y se ejecuta una PCR universal con cebadores RS2 y FS2, que también añade códigos de barras de indexación a cada muestra. Se realiza una limpieza final con microesferas y la biblioteca está completa y lista para la cuantificación y secuenciación.

La compra de los paneles de ARN dirigidos QIAseq proporciona acceso a herramientas de análisis de datos en el portal GeneGlobe de QIAGEN. Estas incluyen alineación de lecturas, normalización de datos y expresión génica diferencial sin coste adicional.

Aplicaciones

- Perfil de expresión genética
- Investigación de biomarcadores
- Confirmación de los datos de secuenciación del transcriptoma completo
- Confirmación de datos de microarrays