Qiagen, 333842, Panel de regiones QIAseq 16S/ITS (24)

Cebadores en fase, enzimas, tampones y perlas para la construcción de bibliotecas para plataformas Illumina; suficiente para 24 muestras

Características

- Interrogar regiones variables de genes específicos del ARNr 16S bacteriano y regiones ITS fúngicas
- Los "cebadores en fase" aumentan la calidad de la base y de la lectura.
- Los reactivos de baja carga biológica minimizan la contaminación de fondo
- Entrada de ADN de tan solo 1 pg para perfilar muestras de baja biomasa

Detalles del producto

Los paneles QIAseq 16S/ITS son la solución integral para la caracterización robusta de comunidades bacterianas y fúngicas. Estos paneles se han desarrollado para la secuenciación de ARNr 16S y regiones ITS en plataformas Illumina. A diferencia de otras soluciones, los paneles QIAseq 16S/ITS utilizan cebadores en fase para mejorar la calidad de las lecturas y la identificación de bases, eliminando la necesidad de añadir PhiX. Además, incorporan reactivos de baja carga biológica para reducir la contaminación de fondo, analizar todas las regiones variables del ARNr 16S y permitir una baja entrada de ADN, lo que facilita el análisis de muestras de baja biomasa.

Los paneles de regiones QIAseq 16S/ITS, al combinarse con cualquiera de los kits de índice QIAseq 16S/ITS, incluyen todos los reactivos necesarios para producir bibliotecas a partir del ADN extraído. Los paneles de regiones pueden configurarse para identificar 1, 2 o 3 regiones variables 16S y/o ITS. Para configurar su panel de regiones QIAseq 16S/ITS, seleccione un producto en la pestaña "Información de pedido" y haga clic en "Configurar".

Actuación

Alta calidad de lecturas y bases.

La secuenciación de bibliotecas de amplicones individuales a menudo produce resultados de baja calidad debido a la diversidad reducida en la composición de bases en las regiones de los cebadores (figura Los paneles QIAseq 16S/ITS emplean cebadores en fase para aumentar la diversidad de bases y las puntuaciones de calidad , A y C). Para superar este problema, los paneles QIAseq 16S/ITS utilizan un enfoque de "cebador en fase" (figura Estructura de los cebadores en fase utilizados en los paneles QIAseq 16S/ITS ), que incorpora de 0 a 11 bases adicionales al extremo 5' del ARNr 16S o cebador ITS. El uso de "cebadores en fase" resulta en un cambio en el equilibrio de nucleótidos y aumenta la diversidad de bases, lo que lleva a un aumento en las puntuaciones de calidad (figura Los paneles QIAseq 16S/ITS emplean cebadores en fase para aumentar la diversidad de bases y las puntuaciones de calidad , B y D).

Uso eficiente del rendimiento de la celda de flujo

Debido al enfoque de "cebador en fase", las bibliotecas producidas con los paneles QIAseq 16S/ITS son lo suficientemente complejas como para eliminar la necesidad de añadir PhiX, lo que permite la utilización eficiente del rendimiento de la celda de flujo.

Bajo ruido de fondo

El ADN bacteriano está presente en todos los aspectos de nuestra vida diaria, lo que aumenta el riesgo de contaminación durante la manipulación y el procesamiento de muestras biológicas. Además, la fabricación y el procesamiento de enzimas y reactivos pueden introducir ADN bacteriano exógeno en las muestras estudiadas. Este fondo de contaminación reduce la robustez del perfil bacteriano. Los paneles QIAseq 16S/ITS utilizan reactivos de baja carga biológica, que muestran niveles muy bajos de contaminación bacteriana exógena en las ejecuciones de NTC (figura 1). Los paneles QIAseq 16S/ITS presentan niveles muy bajos de contaminación de fondo debido al uso de reactivos de baja carga biológica.

Baja entrada de ADN

Los paneles QIAseq 16S/ITS pueden utilizarse con una entrada de ADN bacteriano de entre 1 pg y 1 ng, lo que permite perfilar comunidades bacterianas en muestras con baja biomasa (figura 1). Para el perfilado de comunidades/especies fúngicas, los paneles QIAseq 16S/ITS pueden detectar 0,01 ng de ADN fúngico en un fondo de 1 ng de ADN de E. coli.

Multiplexación

Cada panel permite multiplexar hasta 96 muestras en una serie de Illumina MiSeq con la química de secuenciación V3 a 2x300. Se requiere el kit de índice adecuado para multiplexar el número de muestras necesario.

Análisis de datos

Tras la secuenciación, los datos se analizan utilizando QIAGEN Bioinformatics CLC Genomic Workbench y el módulo Microbial Genomics Pro Suite. Se dispone de un flujo de trabajo personalizado, que puede modificarse según sea necesario, para automatizar la importación de archivos FASTQ, la demultiplexación de bibliotecas de muestras, el filtrado y recorte con control de calidad, la agrupación en clústeres OUT y el análisis bioinformático secundario. QIAGEN Bioinformatics CLC Genomics Workbench, junto con el módulo Microbial Genomics Pro Suite, permite a los investigadores generar informes estandarizados sobre las métricas de calidad de las bibliotecas de muestras y las tablas de abundancia de organismos, ofreciendo numerosas opciones para el análisis interactivo posterior de los perfiles del microbioma y la elaboración de informes sobre los resultados experimentales. El módulo Microbial Genomics Pro Suite también incluye herramientas para calcular las métricas de diversidad y comparar los perfiles microbianos de diferentes muestras. CLC Genomics Workbench genera cifras de calidad de publicación en formatos fáciles de usar para que los investigadores presenten sus resultados.

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Principio

- Perfilar la mayoría de los taxones bacterianos que residen en una muestra en un solo análisis
- Realizar estudios comparativos de diferentes comunidades bacterianas.
- Caracterizar bacterias que no pueden cultivarse.
- Clasificar los microbios con mayor rapidez y precisión que los métodos tradicionales
- Multiplexar muestras en la misma ejecución de secuenciación, lo que proporciona una solución más rentable
- Estudiar microbiomas complejos

- Mala calidad de lectura y llamada de base como resultado de la complejidad reducida de la biblioteca
- Uso ineficiente del rendimiento disponible por biblioteca debido al requisito de una cantidad considerable de ADN PhiX
- Especificidad de clasificación reducida para muchos taxones bacterianos causada por la cobertura incompleta de todas las regiones variables del ARNr 16S
- Alto ruido de fondo debido a reactivos contaminados

Introducción

El método más común para caracterizar las comunidades microbianas es la secuenciación del gen del ARN ribosómico 16S (ARNr) y de las regiones del espaciador transcrito interno (ITS) para bacterias y hongos, respectivamente. Debido a su distribución universal y su naturaleza conservada, los genes del ARNr 16S y del ITS son marcadores genéticos bien establecidos que se utilizan para la identificación y clasificación de bacterias y hongos.

Genes 16S e ITS

El gen ARNr 16S consta de regiones altamente conservadas e hipervariables (figura 1. Estructura del gen ARNr 16S bacteriano [arriba] y de la región ITS fúngica [abajo]). Las regiones conservadas sirven como sitios de unión de cebadores para la amplificación por PCR de las regiones variables, las cuales contienen secuencias que pueden utilizarse para la identificación y clasificación bacteriana.

La región ITS se sitúa entre las subunidades pequeña y grande del ARN ribosómico (ARNr). En eucariotas, existen dos regiones ITS: ITS1, ubicada entre los genes ARNr 18S y ARNr 5.8S, mientras que ITS2, entre los genes ARNr 5.8S y ARNr 28S (figura 1. Estructura del gen ARNr 16S bacteriano [arriba] y la región ITS fúngica [abajo]). Se ha demostrado que las regiones ITS tienen la mayor probabilidad de identificación exitosa para la más amplia gama de hongos.

Beneficios de la NGS para la secuenciación del gen ARNr 16S y de ITS

La NGS proporciona un método sin cultivo para analizar la comunidad microbiana dentro de una muestra biológica. Con el aumento de la productividad de los sistemas modernos de NGS, es frecuente que se multiplexen bibliotecas de múltiples muestras biológicas en la misma secuenciación, lo que ha permitido a los investigadores en microbiología analizar de forma rentable cientos de comunidades microbianas en paralelo. La determinación de la secuencia de genes marcadores universales, como el gen ARNr 16S y el ITS, mediante NGS es un método eficaz para el estudio de comunidades microbianas, ya que permite:

Desafíos actuales con la secuenciación del ARNr 16S y de ITS

Las dificultades con la NGS de los genes ARNr 16S y las regiones ITS incluyen:

Control inteligente

QIAseq 16S/ITS Smart Control es un ADN sintético que puede utilizarse como control positivo en la construcción de la biblioteca, ya que contiene los sitios de unión de los cebadores de Escherichia coli. La región hipervariable del ARNr 16S entre las secuencias de unión de los cebadores se sustituye por secuencias artificiales procedentes de Arabidopsis thaliana (figura 1). Estructura del ADN de QIAseq 16S/ITS Smart Control. Las secuencias artificiales no pueden clasificarse como bacterianas ni fúngicas; por lo tanto, cualquier secuencia clasificada se debe a la contaminación ambiental introducida durante la construcción de la biblioteca.

Procedimiento

Los paneles QIAseq 16S/ITS utilizan un flujo de trabajo de PCR de dos etapas. A partir del ADN extraído de las comunidades bacterianas, las regiones variable e ITS del ARNr 16S se enriquecen en la primera etapa de PCR utilizando los cebadores en fase. Tras una ronda de limpieza de microesferas, se añaden adaptadores de biblioteca a los extremos de los amplicones en la segunda etapa de PCR. Una segunda ronda de limpieza de microesferas genera bibliotecas que pueden cuantificarse y secuenciarse (figura "Flujo de trabajo de los paneles QIAseq 16S/ITS"). La química de secuenciación recomendada es V3 2x300.

Aplicaciones

Detección robusta de especies bacterianas

La composición de una comunidad bacteriana, basada en el gen ARNr 16S, depende de la región variable analizada. Por ejemplo, Streptococcus mutans no puede identificarse mediante la secuenciación de las regiones variables V1V2, V2V3, V3V4 y V4V5. Sin embargo, el análisis exhaustivo de todas las regiones variables con el panel de cribado QIAseq 16S/ITS permite la detección de esta bacteria (figura 1). El cribado de un panel de regiones variables proporciona un perfil bacteriano más robusto que el cribado de regiones variables individuales.