Qiagen, 334355, Panel personalizado de lectura larga QIAseq xHYB (96)

Panel de sonda xHYB personalizado para enriquecimiento de objetivos para secuenciación de lectura larga, panel fijo para 96 ​​muestras

Características

- Alta integridad y uniformidad de cobertura: logre una cobertura integral y uniforme en las regiones objetivo para una detección precisa de variantes.
- Captura híbrida de referencia: garantiza una alta especificidad y sensibilidad para el enriquecimiento del objetivo.
- Longitud de lectura larga: abarca regiones genómicas complejas y repetitivas con una longitud de lectura suficiente para una detección y clasificación de variantes precisas
- Flexible y personalizable: adapte los paneles a necesidades de investigación y presupuestos específicos.
- Optimizado para plataformas de lectura larga: diseñado específicamente para su uso con Pacific Biosciences (PacBio) y Oxford Nanopore Technologies (ONT)

Detalles del producto

Los paneles de lectura larga QIAseq xHYB ofrecen un enriquecimiento de objetivos basado en captura híbrida altamente específico y sensible para la secuenciación de lectura larga, lo que garantiza una cobertura completa y uniforme en regiones genómicas complejas, incluido un alto contenido de GC y variaciones estructurales.

Estos paneles están optimizados para PacBio (sistemas de lectura larga Revio y Vega) y ONT, y proporcionan datos de alta calidad para análisis posteriores precisos y fiables. Su flexibilidad y opciones de personalización permiten a los investigadores adaptar los experimentos a sus necesidades y presupuestos específicos, mientras que un flujo de trabajo optimizado e intuitivo garantiza su facilidad de uso.

Diseñados para promover la investigación del cáncer, la medicina de precisión y el análisis de variantes estructurales, estos paneles brindan a los científicos conocimientos genómicos integrales e imparciales.

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Actuación

- Desafíos del diseño de cebadores: las regiones altamente polimórficas y repetitivas son difíciles de amplificar de manera eficiente.
- Pérdida de alelos: los desajustes en la unión del cebador pueden provocar una representación incompleta o sesgada de las regiones heterocigotas.
- Escalabilidad limitada: la multiplexación de muchos amplicones grandes es problemática a medida que las regiones genómicas interrogadas se expanden.
- Problemas de resolución de variantes estructurales: los puntos de ruptura en SV grandes pueden estar mal definidos, lo que hace que la colocación del cebador sea difícil y sesgada.

Análisis preciso de regiones genómicas complejas y de alto GC

Los paneles de lectura larga QIAseq xHYB están diseñados para superar las limitaciones de la secuenciación de lectura corta, capturando y analizando con precisión regiones con alto contenido de GC y variaciones estructurales complejas. Estos paneles utilizan tecnología avanzada de captura híbrida para ofrecer información genómica precisa y completa, lo que los convierte en una herramienta esencial para los investigadores que trabajan con regiones genómicas complejas.

Captura híbrida de referencia para alta especificidad y sensibilidad

A diferencia de los métodos basados ​​en amplicones, que pueden introducir sesgos e ineficiencias, los paneles de lectura larga QIAseq xHYB utilizan tecnología de captura híbrida de referencia para garantizar una alta especificidad y sensibilidad. Este método minimiza significativamente las lecturas fuera de objetivo, a la vez que proporciona una cobertura uniforme, incluso en regiones difíciles de secuenciar.

Desbloquear el poder de la secuenciación de lectura larga para el análisis de variación estructural

Las variaciones estructurales (VS), como grandes inserciones, deleciones, inversiones, duplicaciones y translocaciones, desempeñan un papel crucial en el desarrollo de enfermedades, incluido el cáncer hereditario. La secuenciación de lectura larga, mejorada por los paneles de lectura larga QIAseq xHYB, proporciona una visión más completa y precisa del genoma del cáncer, lo que facilita el descubrimiento de biomarcadores y su aplicación en medicina de precisión.

Ventajas sobre la segmentación basada en amplicones

Si bien los métodos basados ​​en amplicones se utilizan comúnmente para la secuenciación dirigida, presentan varias limitaciones, entre ellas:

Por el contrario, los paneles de lectura larga QIAseq xHYB proporcionan una solución híbrida basada en captura que elimina estos problemas, lo que permite una detección más confiable e imparcial de variaciones genómicas complejas.

Bibliotecas de ADN de alta fidelidad con uniformidad excepcional

El kit QIAseq xHYB Long-Read se ha optimizado para producir bibliotecas de ADN humano de alta calidad con una fidelidad excepcional. El diseño de la sonda de captura híbrida garantiza una cobertura uniforme en regiones genómicas con alto índice de GC y otras regiones tradicionalmente complejas, minimizando el sesgo y maximizando la precisión de la secuenciación.

Principio

Los paneles de lectura larga QIAseq xHYB están diseñados para aprovechar al máximo el potencial de la secuenciación de lectura larga, ofreciendo un rendimiento y una eficiencia inigualables. El flujo de trabajo de preparación de la biblioteca genera fragmentos de ADN de 3 a 10 kb mediante fragmentación mecánica (centrífuga) o enzimática de alto rendimiento. Ambos métodos emplean pasos específicos de pulido de extremos y adición de A antes de la ligadura del adaptador. Una selección de tamaño posterior elimina los fragmentos <3 kb para evitar el sesgo de amplificación. Finalmente, la indexación por PCR permite la agrupación de muestras y genera suficiente material para la captura de híbridos.

El enriquecimiento de la biblioteca aprovecha la estrategia de captura por hibridación QIAseq xHYB para el enriquecimiento de fragmentos de 3 a 10 kb. Diseñados para un alto rendimiento, estos paneles garantizan una uniformidad de cobertura, especificidad y sensibilidad excepcionales, lo que permite a los investigadores profundizar en las complejidades genómicas.

Procedimiento

El flujo de trabajo QIAseq xHYB Long-Read comienza con la fragmentación enzimática o mecánica, optimizada para producir fragmentos de ADN de entre 3 kb y 10 kb de longitud. La fragmentación mecánica se realiza con tubos g-TUBE de Covaris mediante cizallamiento físico del ADN según la velocidad de la centrífuga. El cizallamiento mecánico no está optimizado para la fragmentación de alto rendimiento, ya que el manejo y el número de tubos están limitados por el tamaño de la centrífuga y la manipulación física de los tubos g-TUBE. Por el contrario, la fragmentación enzimática facilita la fragmentación de alto rendimiento gracias a un flujo de trabajo sencillo con pipetas multicanal. Para la fragmentación mecánica, el ADN se selecciona por tamaño después de la fragmentación para concentrarlo del volumen de fragmentación de los tubos g-TUBE (50 µL) y eliminar el ADN fragmentado de menos de 3 kb. Los flujos de trabajo de fragmentación mecánica y enzimática utilizan diferentes sistemas de pulido final: la fragmentación enzimática se realiza mediante fragmentación y pulido final basados ​​en FX, y el pulido final para la fragmentación mecánica utiliza pulido basado en ERA y adición de A. Tras el pulido final del ADN fragmentado, se añade una "A" al extremo 3'; este producto está listo para la ligadura del adaptador de lectura larga, donde el adaptador se añade a ambos extremos de los fragmentos de ADN. Tras la ligadura del adaptador, la selección de tamaño basada en microesferas elimina los fragmentos de ADN menores de 3 kb, que se amplificarán preferentemente sobre los fragmentos de ADN más largos si no se eliminan. Las bibliotecas se amplifican posteriormente mediante indexación basada en PCR para permitir la agrupación de muestras y producir la masa suficiente para la posterior captura de híbridos.

Enriquecimiento dirigido por captura híbrida

Las bibliotecas humanas de fragmentos largos, indexadas por PCR y seleccionadas por tamaño, se agrupan con la misma masa de cada biblioteca y se añade un tampón de bloqueo mejorado para evitar la hibridación no específica. Las bibliotecas agrupadas se secan entonces con un sistema SpeedVac. Las bibliotecas agrupadas secas se resuspenden y se desnaturalizan. El panel QIAseq xHYB Long-Read se mezcla con la mezcla de hibridación y se desnaturaliza en un tubo aparte. Después de que ambas bibliotecas agrupadas y el panel QIAseq xHYB Long-Read se enfríen, se añade el panel xHYB Long-Read a las bibliotecas agrupadas y este se coloca durante la noche en un termociclador donde las sondas hibridarán con sus dianas. Después de la incubación durante la noche, las sondas biotiniladas y cualquier producto de captura se unen a microesferas recubiertas de estreptavidina. Las sondas unidas y las microesferas de estreptavidina se lavan para eliminar cualquier fragmento de biblioteca no específico no unido, y la biblioteca unida a estreptavidina se resuspende con el potenciador LR-amp; La elución se realiza con hidróxido de sodio y se neutraliza con tampón HN. A continuación, se realiza una preamplificación de pequeño volumen para convertir el ADN monocatenario capturado en bibliotecas bicatenarias y producir la masa suficiente para una amplificación secundaria eficiente en un volumen mayor, obteniendo material suficiente para el procesamiento de bibliotecas de secuenciación de lectura larga en las plataformas PacBio u Oxford Nanopore. Tras la amplificación, se realiza una selección final del tamaño, se realiza un control de calidad de las bibliotecas resultantes mediante cuantificación Qubit BR y se evalúa la distribución del tamaño mediante uno de los siguientes métodos: electroforesis en gel de agarosa al 0,7%, análisis de ADN genómico QIAxcel o TapeStation, esenciales para determinar la concentración de ADN bicatenario y la distribución del tamaño de las bibliotecas de captura.

Secuenciación de lectura larga

Para la secuenciación de lectura larga de PacBio, las bibliotecas están listas para la ligadura del adaptador SMRTbell tras el control de calidad. Consulte los protocolos de ligadura y carga del adaptador SMRTbell de Pacific Biosciences.

Para la secuenciación de lectura larga de Oxford Nanopore, consulte el Apéndice B: Protocolo para la secuenciación de Oxford Nanopore.

Análisis de datos

El portal de análisis de datos GeneGlobe ofrece un análisis simplificado de datos posteriores para la haplotipificación de HLA. El banco de trabajo de genómica QIAGEN CLC se utiliza para detectar grandes variantes estructurales en cánceres hereditarios.

Aplicaciones

Análisis del desorden de expansión repetida

Detectar y caracterizar con precisión las expansiones repetidas asociadas con trastornos neurológicos y genéticos, como la enfermedad de Huntington, el síndrome del cromosoma X frágil y la distrofia miotónica, garantizando la identificación precisa de las expansiones patógenas.

Tipificación de HLA

La secuenciación de lectura larga resuelve regiones HLA altamente polimórficas, lo que permite una genotipificación precisa de HLA para aplicaciones en compatibilidad de trasplantes, investigación de enfermedades autoinmunes e inmunogenómica.

Fase de variantes genéticas

Determinar la estructura haplotípica de las variantes genómicas a lo largo de distancias extendidas, proporcionando información crucial sobre los patrones de herencia, la expresión específica de alelos y la genética de poblaciones.

Detección de variantes estructurales

Identificar alteraciones genómicas a gran escala, incluidas inserciones, deleciones, inversiones, duplicaciones y translocaciones, con gran precisión, apoyando la investigación en genómica del cáncer, estudios de enfermedades genéticas y biología evolutiva.