Qiagen, 334792, QIAseq TCR UDI de 24 índices (24)

Para indexar muestras de 24 bibliotecas; incluye 24 índices TUDI secados en una placa de 96 pocillos y cubiertas de tiras de 8 pocillos

Características

- La tecnología única de indexación molecular (UMI) elimina los artefactos de amplificación, duplicación y secuenciación para aumentar la precisión
- Perfilar receptores TCR individuales (TCR-alfa, TCR-beta, TCR-gamma, TCR-delta) o combinar paneles para obtener un repertorio inmunológico completo
- La construcción de biblioteca de un solo tubo y los paneles versátiles permiten el análisis de uno, dos, tres o los cuatro receptores a la vez
- La indexación dual única (UDI) minimiza la asignación incorrecta del índice de muestra
- Incluye acceso a GeneGlobe Analyze para el análisis de datos, incluida la alineación de lectura y el informe de clonotipo.

Detalles del producto

El panel QIAseq Targeted RNAseq para el receptor de células T permite la secuenciación dirigida de nueva generación (NGS) del receptor de células T (TCR) expresado en humanos o ratones, que incluye cuatro genes distintos: TCR-alfa, TCR-beta, TCR-gamma y TCR-delta. Esta solución altamente optimizada incorpora índices moleculares únicos (UMI) para facilitar la caracterización ultrasensible y precisa del repertorio inmunitario en células y tejidos, desde 200 pg hasta 1000 ng de ARN total.

El sistema inmunitario adaptativo está compuesto por linfocitos T y B que se unen a antígenos mediante receptores de linfocitos T (TCR) y receptores de linfocitos B (BCR) altamente específicos en sus superficies celulares. Para reconocer un número casi infinito de antígenos potenciales, se genera una amplia diversidad de secuencias de TCR y BCR mediante la recombinación somática V(D)J de los loci de TCR y BCR, y mediante la posterior hipermutación somática y recombinación de cambio de clase del BCR tras la estimulación antigénica. La caracterización precisa de los repertorios de TCR y BCR es clave para comprender las respuestas inmunitarias adaptativas y tiene numerosas aplicaciones en diferentes campos, como el desarrollo de vacunas, la autoinmunidad, la monitorización de la respuesta al tratamiento en neoplasias linfoides y la inmunoterapia.

En comparación con los métodos tradicionales, la secuenciación de nueva generación (NGS) proporciona una imagen de alta resolución sin precedentes del repertorio inmunitario. Sin embargo, muchos métodos de secuenciación del repertorio inmunitario disponibles implican PCR multiplex con cebadores dirigidos a diferentes regiones V o J, lo que puede introducir un sesgo de amplificación considerable.

El panel QIAseq Targeted RNAseq para receptores de células T utiliza índices moleculares únicos (UMI) con tecnología de enriquecimiento QIAseq para crear bibliotecas de RNA-seq específicas de forma robusta para instrumentos NGS. Este enfoque de construcción de bibliotecas mejora considerablemente la uniformidad de la amplificación en comparación con los grupos de cebadores V y J basados ​​en PCR multiplexada. La incorporación de UMI antes de la amplificación reduce aún más el sesgo de amplificación y permite una evaluación precisa y sensible del clonotipo de TCR y la diversidad del repertorio.

El panel QIAseq Targeted RNAseq para receptores de células T es una solución completa, desde la muestra hasta la información, para la caracterización precisa del repertorio inmunitario del TCR mediante NGS. La compra del panel TCR incluye acceso a GeneGlobe Analyze, que contiene un flujo de trabajo altamente optimizado para el mapeo de lecturas y la identificación de clonotipos.

Principio

El panel QIAseq Targeted RNAseq para el receptor de células T proporciona una evaluación precisa y sensible del clonotipo y la diversidad del TCR mediante la tecnología de enriquecimiento de QIAGEN. Se proporcionan cebadores específicos del TCR para la transcripción inversa y el enriquecimiento, junto con todos los reactivos necesarios para la construcción de la biblioteca. El panel QIAseq Targeted RNAseq para el receptor de células T está diseñado para enriquecer las subunidades α, β, γ y σ del TCR (individualmente o combinadas) en una sola reacción utilizando de 200 pg a 1000 ng de ARN (véase la figura "Flujo de trabajo del panel QIAseq Targeted RNAseq para el receptor de células T").

Procedimiento

Especificaciones de muestra
Tipos de ARN: ARN total, ARN FFPE/fragmentado y ARNm enriquecido
Tipo de biblioteca: secuenciación de ARN dirigida con UMI
Objetivos genéticos: Humanos: TRA, TRB, TRD, TRG Ratón: Tcra, Tcrb, Tcrd, Tcrg
Concentración mínima de ARN: 40 pg/µL
Volumen de ARN por reacción de transcripción inversa: 5 µL
Volumen total de la reacción de ADNc: 6 ​​µL
Requisitos de RIN: 1 a 10
DV mínimo 600%: 30%

Especificaciones de secuenciación: Objetivo de la investigación
Tipo de muestra: Encuesta con secuenciación superficial
Leucocitos de sangre periférica: 200 pg a 1000 ng de ARN total: 0,016–80 M lecturas
Sangre completa: 500 pg a 200 ng de ARN total: 0,01–4 M lecturas
Tejido tumoral: 100 ng a 1000 ng de ARN total: 0,12 a 1,2 M de lecturas
Células T purificadas: 10 a 10 000 células de ARN: 0,002–2 M lecturas

Especificaciones del producto
Kits de índices compatibles (obligatorios): 334792 QIAseq 24-Index TCR UDI (24) 334805 QIAseq 96-Index TCR UDI Set A (96)
ARN de control recomendado para supervisar el rendimiento de la biblioteca (se vende por separado): QIAGEN XpressRef Universal Total RNA
Kits de cuantificación de bibliotecas recomendados (se venden por separado): Kit de ensayo de cuantificación de bibliotecas QIAseq, n.º de cat./ID: 333314
Análisis de datos en línea incluido en el kit: GeneGlobe Analyze
Análisis de datos de escritorio independiente (se vende por separado): CLC Genomics Workbench
Instrumentos NGS recomendados: Illumina MiSeq o NextSeq 1000/2000
Ciclos/duración de secuenciación recomendados: Paired-end, 600 ciclos en Illumina NextSeq 1000/2000

síntesis de ADNc

Se parte del ARN total de leucocitos de sangre periférica, sangre completa, linfocitos T enriquecidos o tumores sólidos. Las muestras de ARN se someten primero a transcripción inversa a ADNc con cebadores específicos para cada gen. Posteriormente, se produce la síntesis de la segunda cadena, lo que genera ADNc bicatenario (ADNc-ds). Este ADNc-ds se repara en sus extremos mediante la adición de A en un protocolo de un solo tubo.

Asignación del índice molecular único (UMI)

Antes del enriquecimiento de la diana y la amplificación de la biblioteca, a cada molécula de ADNc original se le asigna un índice molecular único (UMI) de hasta 18 bases. Esto se logra ligando un adaptador de secuencia aleatoria que contiene el UMI al ADNc bicatenario. Estadísticamente, este proceso proporciona más de 268 millones de índices posibles por adaptador, y cada molécula de ADN de la muestra recibe una secuencia UMI única.

Enriquecimiento de objetivos y construcción final de la biblioteca

Tras la asignación de UMI, se aplica la tecnología de enriquecimiento QIAseq para capturar moléculas de ADNc de TCR con UMI en la biblioteca NGS. Para el enriquecimiento, las moléculas de ADNc ligadas se someten a un enriquecimiento específico para TCR utilizando un panel dirigido a TCR. Tras el enriquecimiento, se realiza una PCR universal para amplificar la biblioteca e introducir índices duales únicos.

Adaptador NGS y tecnologías de índice dual único (UDI)

El panel QIAseq Targeted RNAseq para el receptor de células T requiere el QIAseq 24-Index TCR UDI (24) (n.° de cat. 334792) o el QIAseq 96-Index TCR UDI Set A (96) (n.° de cat. 334805), que contienen los adaptadores TUDI y los cebadores de doble índice. El diseño UDI reduce significativamente el riesgo de problemas de sangrado de índice ("saltos de índice") asociados con los instrumentos de secuenciación de nueva generación que utilizan celdas de flujo con patrones. Con el doble índice único (UDI), a cada muestra se le asignarán dos índices de muestra únicos para compensar los errores introducidos por el análisis de imágenes, los errores de secuenciación y la demultiplexación, y para eliminar la asignación incorrecta de datos de secuenciación a muestras incorrectas.

Secuenciación de próxima generación en sistemas NGS de Illumina

El panel QIAseq Targeted RNAseq para el receptor de células T es compatible con los sistemas NGS de Illumina (MiSeq, NextSeq 1000/2000 y NovaSeq 6000). Los mejores resultados de secuenciación se obtienen utilizando celdas de flujo de 500 o 600 ciclos.

Análisis de datos

El pipeline del Repertorio Inmunitario QIAseq realiza automáticamente todos los pasos necesarios para generar informes de diversidad de TCR y clonotipos a partir de sus datos NGS sin procesar. El pipeline del Repertorio Inmunitario QIAseq está disponible a través de paquetes de software en la nube, de escritorio y de servidor. Para análisis en la nube, los investigadores pueden utilizar la sección QIAseq de GeneGlobe Analyze. Para compatibilidad con escritorio y servidor, se puede utilizar QIAGEN Genomics Workbench.