Qiagen, 336841, Kit de ensayo Cignal Reporter

Para 500 ensayos de reportero, 500 ensayos de control negativo y 250 ensayos de control positivo; 500 µl (100 ng/µl) Reportero (reportero de GFP sensible al factor de transcripción inducible); 500 µl (100 ng/µl) Control negativo (construcción de reportero de GFP con expresión de GFP controlada por un promotor mínimo); 250 µl (100 ng/µl) Control positivo (construcción de GFP que expresa constitutivamente)
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Características

- Análisis rápido de la regulación de la vía de transducción de señales
- Sensibilidad y especificidad excepcionales
- Construcciones listas para la transfección
- Incluye controles positivos y negativos
- Cuantificación de células vivas en tiempo real (formato GFP)

Detalles del producto

Los ensayos de reportero Cignal incluidos en el kit de ensayos de reportero Cignal permiten una evaluación rápida, sensible y cuantitativa de la activación de la vía de transducción de señales mediante la medición de la actividad de los factores de transcripción posteriores. Hay dos sistemas de reportero disponibles: formato de luciferasa dual y formato GFP.

Principio

Los ensayos de reporteros Cignal consisten en múltiples repeticiones del sitio de unión de un factor de transcripción específico y elementos promotores básicos para impulsar la expresión de un gen reportero (luciferasa de luciérnaga o GFP). Estos reporteros son herramientas poderosas en la genómica funcional y el descubrimiento de fármacos para evaluar la actividad de la vía. Cuando la vía es activada o inhibida por un fármaco candidato, la inhibición génica, la sobreexpresión o la actividad del reportero peptídico, luciferasa o GFP se modula y puede medirse cuantitativa y rápidamente (véase la figura "Principio del ensayo de reporteros Cignal"). Los ensayos de reporteros Cignal están disponibles como construcciones listas para la transfección utilizando dos sistemas de reporteros: el reportero de luciferasa dual o el reportero de GFP (véase el diagrama de flujo "Procedimiento del ensayo de reporteros Cignal").

El formato de doble luciferasa es un ensayo de punto final que ofrece una sensibilidad, especificidad y una relación señal-ruido inigualables. Este formato está disponible para todos los ensayos de reporteros Cignal. Cada ensayo incluye un reportero de factor de transcripción centrado en la vía y un control negativo no inducible, así como controles positivos de luciferasa y GFP.

El formato GFP es un método excepcional para monitorizar la regulación de vías celulares vivas, con resolución unicelular. Incluye un reportero de factor de transcripción centrado en la vía y controles positivos y negativos.

Procedimiento

Los ensayos de reportero de Cignal incluyen un reportero de la vía de señalización preformulado y listo para la transfección (luciferasa dual o GFP), además de un control positivo y negativo. El reportero de la vía inducible y el control negativo no inducible se transfectan y se someten a tratamientos experimentales en paralelo.

Luciferasa dual

Se calculan los resultados de luciferasa dual para cada transfectante. El cambio en la actividad de cada vía de señalización se determina comparando las actividades de luciferasa normalizadas del reportero en los transfectantes tratados con respecto a los no tratados. Los transfectantes de control negativo, tratados de forma idéntica, sirven como control de especificidad. El control positivo sirve como control de la eficiencia de la transfección, mediante la monitorización de la expresión de luciferasa de luciérnaga y Renilla.

GFP

La expresión de GFP se cuantifica mediante un citómetro de flujo, un microscopio de fluorescencia o un fluorómetro. El cambio en la actividad de cada vía de señalización se determina comparando la actividad de GFP en los transfectantes tratados con los no tratados. Los transfectantes de control negativo, tratados de forma idéntica, sirven como control de especificidad. El control positivo sirve como control de la eficiencia de la transfección, monitorizando la expresión de GFP a partir del reportero CMV-GFP con expresión constitutiva.

Aplicaciones

Los ensayos Cignal Reporter son herramientas poderosas en genómica funcional, proteómica y descubrimiento de fármacos para evaluar el impacto biológico de la inhibición o activación de vías con ARNi, proteínas y compuestos de moléculas pequeñas.