Qiagen, 339306, ensayo de PCR de miARN LNA miRCURY

Contiene cebadores directos e inversos para 200 reacciones de qPCR en tiempo real basadas en SYBR® Green, 166 reacciones de PCR digital basadas en EvaGreen para Nanoplate 8.5k o 50 reacciones de PCR digital basadas en EvaGreen para Nanoplate 26k

Características

- La sensibilidad inigualable permite la cuantificación de miRNA a partir de solo 1 pg de ARN total
- Ideal para muestras con bajo rendimiento de ARN, como suero/plasma, secciones FFPE y muestras LCM
- La alta especificidad discrimina entre miRNA estrechamente relacionados y miRNA maduros de precursores.
- Protocolo rápido y sencillo de dos pasos que tarda menos de 3 horas.
- La cobertura completa de miRBase permite la elaboración de perfiles de miRNA de cualquier organismo

Detalles del producto

Los ensayos de PCR de miARN miRCURY LNA son conjuntos de cebadores de PCR de miARN individuales que permiten una cuantificación de miARN extremadamente sensible y específica con el sistema de PCR de miARN miRCURY LNA. Tanto los cebadores de amplificación por PCR directa como inversa son específicos para miARN y están optimizados con tecnología LNA. Los ensayos están disponibles en formato de tubo o placa con 200 reacciones por tubo o pocillo.

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Actuación

Sensibilidad inigualable

La excepcional sensibilidad de los ensayos de PCR de miARN miRCURY LNA se logra combinando la transcripción inversa universal con cebadores potenciados por LNA y normalizados por Tm. Esta combinación permite una cuantificación precisa y fiable de miARN individuales a partir de tan solo 1 pg de ARN total introducido en la síntesis inicial de ADNc de primera cadena (véase la figura «Cuantificación precisa a partir de 1 pg de ARN total como material de partida»).

En comparación con otros sistemas de PCR en tiempo real de miRNA que utilizan cebadores de tallo-bucle o de ADN estándar, los cebadores mejorados con LNA ofrecen una sensibilidad significativamente mayor, especialmente para miRNA ricos en AT (ver figura Los cebadores mejorados con LNA dan como resultado una sensibilidad mucho mayor en comparación con los cebadores de ADN).

Los bajos requisitos de muestra también permiten la cuantificación de miRNA utilizando ARN total purificado de muestras difíciles, como muestras de LCM y suero/plasma (consulte las figuras Detección de la expresión diferencial de miRNA en muestras de LCM de secciones de tejido FFPE y Diferencias en la expresión de miRNA entre muestras de suero).

Totalmente validado y optimizado

Todos los ensayos de PCR miRCURY LNA miRNA validados en laboratorio se han optimizado para ofrecer la máxima sensibilidad. Más del 80 % de los ensayos detectan al menos 5 copias de miRNA en la reacción de PCR (véase la figura «Dilución seriada de hsa-miR-181a»). Los conjuntos de cebadores también se han validado para la amplificación específica de la diana y para minimizar la señal de fondo (véase la figura «Amplificación específica y sensible de miRNA»).

La única plataforma con perfecta especificidad

Los ensayos de PCR de miARN miRCURY LNA son la única plataforma de cuantificación de miARN con especificidad absoluta (véase el estudio miRQC publicado en Nature Methods) y superaron a otra plataforma de qPCR de miARN basada en sonda en pruebas de especificidad (véase la figura "Prueba de especificidad con sistema de qPCR de miARN basado en sonda"). Su perfecta especificidad elimina los falsos positivos y garantiza señales de miARN robustas y fiables.

Discriminación superior

La incorporación de LNA en los cebadores de amplificación por PCR, tanto directa como inversa, permite diseñar ensayos que distinguen entre secuencias de miARN que difieren en un solo nucleótido (véase la figura «Discriminación de un solo nucleótido»). Además, los ensayos pueden distinguir entre secuencias de miARN maduras y precursoras.

Rápido, fácil y reproducible

El protocolo de 3 horas, fácil de seguir, le ahorra tiempo y esfuerzo en el laboratorio. Al utilizar la misma reacción de RT como plantilla en todas las reacciones de PCR posteriores, el procedimiento se simplifica considerablemente en comparación con los sistemas que requieren la síntesis de la primera cadena específica de miRNA. El número de pasos de pipeteo se reduce al mínimo y se minimiza la variación técnica. Esto permite lograr una reproducibilidad extremadamente alta día a día e incluso entre centros.

Los ensayos de PCR de miARN miRCURY LNA se han optimizado para su uso con el kit de RT miRCURY LNA y el kit de PCR miRCURY LNA SYBR Green. El uso de otros reactivos afectará la calidad de los resultados.

Principio

Nombre del producto: Organismo objetivo
Conjunto de cebadores de control, SNORD38B (hsa): hsa
Conjunto de cebadores de control, SNORD44 (hsa): hsa
Conjunto de cebadores de control, SNORD48 (hsa): hsa
Conjunto de cebadores de control, SNORD49A (hsa): hsa
Conjunto de cebadores de control, SNORA66 (hsa): hsa
Conjunto de cebadores de control, ARNr 5S (hsa): hsa, mmu
Conjunto de cebadores de control, ARNm U6 (hsa, mmu): hsa, mmu, rno
Conjunto de cebadores de control, ARNm pequeño RNU5G (mmu, hsa): mmu, hsa, rno
Conjunto de cebadores de control, RNU1A1 (mmu, hsa): mmu, hsa, rno
Conjunto de cebadores de control, SNORD65 (mmu): mmu
Conjunto de cebadores de control, SNORD68 (mmu): mmu
Juego de cebadores de control, SNORD110 (mmu): mmu

Un sistema único para la elaboración de perfiles de miRNA

Los ensayos de PCR miRCURY LNA miRNA ofrecen la mejor combinación de rendimiento y facilidad de uso disponible en el mercado de PCR en tiempo real de microARN al combinar la RT universal con la amplificación por PCR de LNA (ver figura Esquema del sistema de PCR miRCURY LNA miRNA). La RT universal permite usar una reacción de síntesis de ADNc de primera cadena como plantilla para múltiples ensayos de PCR en tiempo real de miARN. Esto ahorra muestras valiosas, reduce la variación técnica y ahorra tiempo en el laboratorio. Además, los cebadores de amplificación por PCR tanto directos como inversos son específicos de miARN y están optimizados con LNA. Esto proporciona 1) una sensibilidad excepcional y un fondo extremadamente bajo, lo que permite una cuantificación precisa de niveles muy bajos de miARN y 2) ensayos altamente específicos que permiten la discriminación entre secuencias de miARN estrechamente relacionadas.

Cobertura

Más de 20.000 ensayos están disponibles cubriendo todos los organismos en miRBase 20. Más de 1.400 ensayos están completamente validados en laboratorio húmedo para sensibilidad, especificidad, eficiencia y fondo tanto en muestras sintéticas como biológicas diferentes. Los ensayos restantes están validados in silico utilizando un algoritmo de diseño integral que garantiza ensayos de alta calidad, específicos de la especie y mejorados con LNA con sensibilidad y especificidad óptimas dentro de cada organismo. Esto significa que varios ensayos diferentes pueden dirigirse a la misma secuencia. En última instancia, el ensayo para cada especie se selecciona en función del fondo genético del organismo. Si está trabajando con nuevos miRNAs, como de un experimento NGS, también hay disponibles conjuntos de cebadores de miRNA LNA diseñados a medida para cualquier miRNA.

Ensayos de genes de referencia para normalización

Se encuentran disponibles nueve conjuntos de cebadores de genes de referencia, lo que permite una normalización de datos de alta calidad y la generación de datos fiables a partir de diversos tipos de muestras (véase la tabla a continuación). Estos conjuntos de cebadores de control se dirigen a ARN endógenos pequeños, no codificantes, que se expresan de forma constitutiva y relativamente estable en diferentes tejidos humanos (véase la figura "Niveles de expresión de genes de referencia en diferentes tejidos humanos"). Los genes de referencia de control cubren un amplio rango de valores de Cq, lo que permite una normalización precisa y fiable en diversos niveles de expresión de miARN.

Los conjuntos de cebadores de control se han validado como genes de referencia para el sistema de PCR de miRNA miRCURY LNA y funcionan de forma óptima con el kit de RT miRCURY LNA y los kits de PCR miRCURY LNA SYBR Green. Es fundamental confirmar siempre la expresión consistente e invariable de un gen en todos los tejidos y bajo todos los tratamientos de un experimento antes de seleccionarlo como referencia. Recomendamos analizar varios genes de referencia y utilizar programas como GeNorm y NormFinder (parte del software GenEx) para seleccionar y validar los genes de referencia.

Aplicaciones

- Cuantificación de miRNA maduros
- detección de snoRNA