Qiagen, 396052, AdnaTest LungCancerDetect

Para el aislamiento de 12 ARNm de CTC, transcripción inversa y posterior detección de la expresión génica asociada al cáncer de pulmón de transición epitelial-mesenquimal (EMT) mediante PCR de punto final.

Características

- Aislamiento y detección eficiente de CTC de sangre completa
- Caracterización molecular de CTC
- Alta especificidad y sensibilidad
- Minimiza el sesgo leucocitario con AdnaWash Leukocyte Reducer

Actuación

ALDH1: GA733-2
Muestras de donantes sanos no enriquecidas: 0/20
Especificidad: 100%
Muestras de donantes sanos enriquecidas: 20/20
Recuperación: 100%

AdnaTest LungCancer es un sistema inmunomagnético de selección celular altamente específico para enriquecer células tumorales circulantes de sangre periférica. Incluye una RT-PCR de alta sensibilidad para la detección de marcadores de ARNm asociados al cáncer de pulmón. La especificidad de detección de AdnaTest LungCancer es del 95 %. Utilizando marcadores tumorales para cáncer de pulmón en experimentos de adición, se detectan 30 células tumorales en 5 ml de sangre con una tasa de recuperación del 100 % (Tabla a continuación: Especificidad y recuperación de AdnaTest LungCancer).

En aproximadamente el 80% de las CTC de muestras de cáncer de pulmón, se observa el metabolismo de la EMT y de las células madre tumorales. Las CTC analizadas dieron positivo para al menos uno de los marcadores de EMT: Twist1, Akt2 y PI3KCA. AdnaTest LungCancer proporciona, además de anticuerpos anti-EpCam, anticuerpos contra Her2 y EGFR, lo que resulta en un aumento considerable del rendimiento (véase "Mayor sensibilidad en cáncer de pulmón"). Para cubrir los marcadores tumorales mencionados, AdnaTest LungCancer contiene mezclas de cebadores para la detección de EMT y marcadores asociados al cáncer de pulmón. Los hallazgos con sistemas de detección basados ​​únicamente en EpCam como diana de captura alcanzaron solo un 15% de positividad, mientras que AdnaTest CTC-Select utiliza anticuerpos anti-EpCam, anti-Her2 y anti-EGFR en combinación. El análisis de la expresión de EpCam permite la diferenciación de células epiteliales, células similares a EMT y células con características de células madre tumorales.

La reducción de leucocitos es fundamental para minimizar el sesgo leucocitario.

La detección de marcadores relacionados con la pluripotencia tumoral, como ALDH1, o marcadores relacionados con la EMT, como Twist1, Akt2 o PI3KCα, requiere una pureza significativamente mayor para eliminar el sesgo de los leucocitos contaminantes. El reductor de leucocitos AdnaWash es un tampón especial desarrollado para reducir el contenido leucocitario durante el enriquecimiento de CTC. El uso de un ensayo de PCR de punto final de CD45 demuestra claramente que el número de leucocitos se reduce drásticamente utilizando AdnaWash en el procedimiento de captura celular en lugar de PBS (véase "Reducción de leucocitos con AdnaWash").

Procedimiento

Gen objetivo: tamaño del fragmento
PI3Kα: 551 pb
Akt-2: 309 pb
TWIST1: 201 pb
Actina: 120 pb (control interno de PCR)

Gen objetivo: tamaño del fragmento de PCR
EpCam (GA733-2): 395 pb
ALDH1: 161 pb

El AdnaTest utiliza un proceso de dos pasos (Seleccionar y Detectar) para generar resultados en 5 horas (ver “AdnaTest CTC-Select: Selección de células inmunomagnéticas con múltiples anticuerpos asociados a tumores.” y “AdnaTest LungCancerDetect para el análisis de varios marcadores tumorales asociados al cáncer.”). AdnaTest CTC-Select permite el enriquecimiento inmunomagnético de células tumorales de sangre completa a través de antígenos epiteliales y asociados a tumores. Los anticuerpos contra antígenos epiteliales y asociados a tumores se conjugan con perlas magnéticas para el marcaje de células tumorales. Las células marcadas se extraen mediante un concentrador de partículas magnéticas (AdnaMag-L y AdnaMag-S) y posteriormente se lisan. (ver “AdnaTest Select: Selección de células inmunomagnéticas con múltiples anticuerpos asociados a tumores marcados con perlas magnéticas”). El lisado celular se utiliza luego en AdnaTest LungCancerDetect, paso 2 del procedimiento, para aislar el ARNm. AdnaTest LungCancerDetect contiene microesferas recubiertas con Oligo (dT) 25 para aislar el ARNm del lisado de células tumorales preenriquecidas. La transcripción inversa produce ADNc que posteriormente puede utilizarse como plantilla para la detección y caracterización de células tumorales mediante PCR multiplex (véase "AdnaTest LungCancerDetect para el análisis de diversos marcadores tumorales asociados al cáncer"). La PCR multiplex proporciona perfiles de expresión génica asociados al tumor para diversos marcadores tumorales relevantes, lo que garantiza que las células seleccionadas sean cancerosas (véase "Resultados de AdnaTest LungCancerDetect de muestras con un bioanalizador Agilent 2100"). El kit contiene una mezcla de cebadores para amplificar los fragmentos diana de ADNc de Twist, PI3Kα, Akt2 y un gen constitutivo como control (actina) (véase "Especificidad y recuperación de AdnaTest LungCancer"). El PrimerMix LungDetect amplifica ALDH1 y EpCam (GA733-2) (abajo). Los cebadores generan fragmentos de los siguientes tamaños:

Es importante destacar que AdnaTest es una plataforma abierta que permite la elaboración de perfiles de objetivos de ARNm personalizados adicionales para el descubrimiento integral de biomarcadores.

Aplicaciones

- Aislamiento de CTC de sangre humana completa
- Caracterización molecular de CTC
- Descubrimiento de biomarcadores
- Perfil de ARNm
- Biopsia líquida
- Investigación sobre el cáncer