Qiagen, 59720, Kit de bisulfito EpiTect Fast 96

2 placas EpiTect de 96 pocillos, solución de bisulfito, tampón de protección de ADN, ARN transportador, tampones

Características

- El procedimiento optimizado permite altas tasas de conversión de citosina de más del 99 %
- Conversión eficiente de bisulfito en tan solo 30 minutos
- Soluciones dedicadas para ADNg, sangre completa, células, tejidos y cortes FFPE
- Procedimiento rápido y optimizado para la conversión y purificación eficiente del ADN, también en placas de 96 pocillos
- La exclusiva tecnología DNA Protect previene la degradación del ADN

Detalles del producto

Los kits de conversión rápida de bisulfito EpiTect son un sistema coordinado de kits que permiten una conversión altamente eficiente de citosinas no metiladas a uracilos en tan solo 30 minutos, a la vez que ofrecen una flexibilidad excepcional en la elección del material de partida. Los procedimientos optimizados para la lisis de muestras y la conversión directa de ADN con bisulfito a partir de sangre completa, células cultivadas, muestras de tejido, ADN genómico y cortes fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE) permiten una conversión eficiente con bisulfito rápida y sencilla. La innovadora tecnología DNA Protect garantiza una desnaturalización eficaz del ADN sin degradación, lo que resulta en un alto rendimiento de ADN y resultados reproducibles. Los procedimientos de columna de centrifugación se pueden automatizar en QIAcube Connect. El procedimiento en formato de 96 pocillos proporciona una conversión de ADN con bisulfito ultrarrápida y de alto rendimiento, y se puede procesar mediante una centrífuga o un colector de vacío.

Actuación

Conversión de bisulfito de alta eficiencia

El tratamiento del ADN con bisulfito y la consiguiente conversión de citosinas no metiladas a uracilos es el paso más crítico en el análisis de metilación, ya que la eficiencia de la reacción afectará considerablemente la fiabilidad de los análisis posteriores. Los kits de conversión rápida de bisulfito EpiTect contienen una innovadora solución de bisulfito que permite una conversión ultrarrápida y altamente eficiente, incluso en muestras difíciles de analizar, como el ADN genómico del cromosoma X derivado de una muestra femenina, donde uno de los dos cromosomas X está altamente metilado (véase la figura "Conversión de citosina altamente eficiente del ADN del cromosoma X"). La cuantificación de la conversión individual de citosinas mediante pirosecuenciación muestra que se logra una conversión significativamente mejor con el kit de conversión rápida de bisulfito EpiTect que con un kit de otro proveedor, especialmente cuando la cantidad de material de partida es limitada (véase la figura "Conversión superior de bisulfito").

Fragmentación reducida del ADN

Las duras condiciones necesarias para la conversión completa con bisulfito suelen provocar un alto grado de fragmentación del ADN y pérdida de muestras, lo que resulta en un bajo rendimiento de ADN, ADN altamente fragmentado y tasas de conversión irreproducibles. El exclusivo tampón DNA Protect de QIAGEN previene la degradación del ADN, lo que resulta en ADN completamente convertido con fragmentos de tamaño mucho mayor que el ADN convertido con kits de otros proveedores (véase la figura "Análisis del tamaño de los fragmentos de ADN tras la conversión con bisulfito"). Mezcla de RT optimizada para una transcripción inversa eficiente y sensible con un amplio rango de cantidades de ARN molde. Para mayor comodidad, la mezcla maestra se puede almacenar a 2–8 °C.

Principio

La conversión rápida y completa del ADN de muestra con bisulfito es esencial para un análisis preciso de la metilación del ADN. Los kits EpiTect Fast Bisulfite Conversion incluyen una innovadora solución de bisulfito que permite una conversión altamente eficiente en tan solo 30 minutos. Los protocolos optimizados de lisis y conversión de muestras permiten una purificación y conversión del ADN con bisulfito eficientes, mientras que la exclusiva tecnología DNA Protect minimiza la fragmentación del ADN durante el tratamiento con bisulfito. Los 3 kits EpiTect Fast Bisulfite Conversion y los kits EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion están interconectados y funcionan como un sistema integrado de soluciones para la conversión directa de ADN con bisulfito a partir de una amplia gama de materiales de partida (véanse las figuras "Protocolos interconectados de los kits EpiTect Fast Bisulfite Conversion"). Sin embargo, cada kit tiene características únicas, se adapta a un tipo de muestra específico e incluye todos los tampones y reactivos necesarios para funcionar de forma independiente. Los componentes de cada kit se combinan para proporcionar una lisis eficaz de las muestras, una pérdida mínima de ADN durante la lisis, una conversión completa de bisulfito, una protección sólida durante la conversión y una limpieza exhaustiva del ADN.

Conversión rápida de bisulfito

Los kits de conversión rápida con bisulfito EpiTect ofrecen un procedimiento rápido y optimizado para la conversión y purificación eficientes de ADN preparado a partir de ADN genómico, FFPE, sangre, células o muestras de tejido. Los kits contienen una solución de bisulfito altamente concentrada, que reduce el tiempo necesario para convertir los residuos de citosina no metilados en uracilo de varias horas a tan solo 30 minutos, así como tampones de preparación que evitan el aislamiento del ADN previo al tratamiento con bisulfito. Además, el programa de ciclado térmico con bisulfito proporciona una serie optimizada de pasos de incubación necesarios para la desnaturalización térmica del ADN y la posterior sulfonación y desaminación de la citosina, lo que permite tasas de conversión de citosina superiores al 99 %. La desulfonación, el paso final de la conversión química de las citosinas, se logra mediante un práctico paso en columna incluido en el procedimiento de purificación.

Tampón de protección de ADN

La conversión rápida y completa del ADN de muestra con bisulfito es el paso más crítico para la correcta determinación de un patrón de metilación. Esto se logra incubando el ADN en altas concentraciones de sal de bisulfito a alta temperatura y bajo pH. Estas duras condiciones suelen provocar un alto grado de fragmentación del ADN y su consiguiente pérdida durante la purificación. Los procedimientos habituales con bisulfito suelen requerir grandes cantidades de ADN de entrada para compensar la degradación y la pérdida de ADN durante la conversión, lo que a menudo resulta en un bajo rendimiento de ADN, un ADN altamente fragmentado y tasas de conversión irreproducibles. Con los kits de conversión rápida con bisulfito EpiTect, la fragmentación del ADN se previene durante la conversión con bisulfito gracias al exclusivo tampón DNA Protect, formulado específicamente para prevenir la fragmentación que suele asociarse con el tratamiento del ADN con bisulfito a altas temperaturas y bajo pH. También proporciona una desnaturalización eficaz del ADN, lo que resulta en el ADN monocatenario necesario para la conversión completa de citosina. El tampón DNA Protect también contiene un práctico colorante indicador de pH que sirve como control de mezcla y que permite confirmar el pH correcto para la conversión de citosina (ver figura "Tampón DNA Protect").

Desparafinación de muestras FFPE

El primer paso para extraer ADN de muestras FFPE es la desparafinación, que consiste en disolver y eliminar la parafina, exponiendo las muestras para su posterior tratamiento con tampón de lisis y proteinasa K. Con el kit EpiTect Fast FFPE Bisulfite, la desparafinación, la lisis y la desreticulación de cortes FFPE se optimizan con la solución de desparafinación, un producto químico innovador que facilita la desparafinación con mínima manipulación. La solución de desparafinación contribuye a altas tasas de recuperación de ADN, ya que permanece en la muestra mientras se realiza la digestión con proteinasa K. Al no ser necesario sedimentar la muestra FFPE ni eliminar el sobrenadante parafinoso, se evita el riesgo de pérdida de muestra durante la desparafinación.

Procedimiento

Los procedimientos del kit EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit constan de unos sencillos pasos: preparación del ADN a partir de una muestra, conversión de citosinas no metiladas mediante bisulfito; unión del ADN monocatenario convertido a la membrana de una columna de centrifugación de ADN MinElute o a la membrana de una placa EpiTect de 96 pocillos; lavado; desulfonación del ADN unido a la membrana; lavado del ADN unido a la membrana para eliminar el agente desulfonante; y elución del ADN puro y convertido de la columna de centrifugación o placa de 96 pocillos. La preparación de la muestra varía según el tipo de corte FFPE, sangre completa, cultivos celulares o tejidos, mientras que el procedimiento de conversión de ADN extraído con bisulfito es el mismo para todos los tipos de muestra (véase la figura "Protocolos interconectados de los kits EpiTect Fast Conversion Kits"). Todos los protocolos alcanzan las mismas tasas de conversión de citosinas y producen la misma recuperación de ADN tras la purificación del ADN convertido, independientemente de las cantidades iniciales de ADN.

Descripciones de los kits

Kit de bisulfito de ADN EpiTect Fast y kit de bisulfito de ADN EpiTect Fast 96

Los kits EpiTect Fast DNA Bisulfite incluyen tampones y reactivos cuidadosamente formulados para facilitar una conversión de ADN genómico con bisulfito optimizada y eficaz, así como la posterior purificación del ADN convertido (véanse las figuras "Procedimiento del kit EpiTect Fast DNA Bisulfite" y "Procedimiento del kit EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite"). La novedosa solución de bisulfito permite una conversión completa en tan solo 30 minutos, mientras que la tecnología DNA Protect y las columnas de centrifugación o placas de 96 pocillos de QIAGEN permiten la generación de ADN completamente convertido con una degradación mínima, que puede eluirse en tan solo 10 µl de tampón para aplicaciones posteriores que requieren altas concentraciones de ADN. Los kits EpiTect Fast DNA Bisulfite pueden utilizarse para la conversión de 1 ng–2 µg de ADN en un volumen de hasta 20 µl, o de 1–500 ng en un volumen máximo de 40 µl.

Kit de bisulfito EpiTect Fast FFPE

Los tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) se procesan con el kit EpiTect Fast FFPE Bisulfite, que consta del kit EpiTect Fast FFPE Lysis, que contiene tampones especializados para una desparafinización y lisis eficientes de cortes de tejido FFPE (véase la figura "Procedimiento del kit EpiTect Fast FFPE Bisulfite"), y el kit EpiTect Fast DNA Bisulfite para una conversión rápida y eficaz del ADN extraído mediante bisulfito. El protocolo incluye un paso optimizado para facilitar la unión del ADN y puede utilizarse con cortes individuales de tejido FFPE (10 µm de grosor). La fragmentación del ADN que inevitablemente se produce al extraer ADN de tejidos FFPE se ve agravada por las duras condiciones del tratamiento posterior con bisulfito. La fiable tecnología DNA Protect de QIAGEN minimiza la fragmentación durante la reacción de conversión, lo que resulta en una mayor producción de ADN convertido mediante bisulfito.

Kit de bisulfito EpiTect Fast LyseAll (solo formato de columna de centrifugación)

Las muestras de sangre completa, células cultivadas o tejido se procesan con el kit EpiTect Fast LyseAll Bisulfite, que consta del kit de lisis EpiTect Fast LyseAll (véase la figura "Procedimiento del kit EpiTect Fast LyseAll Bisulfite") con un innovador tampón de lisis y el kit EpiTect Fast DNA Bisulfite para la conversión con bisulfito del ADN extraído. El protocolo incluye un paso optimizado para facilitar la unión del ADN, junto con tampones de lisis de fórmula única para optimizar la liberación del ADN de las muestras. Este kit puede utilizarse con 0,5–20 µl de sangre o 10–10⁻¹ células (tan solo 60 pg de ADN).

Aplicaciones

- PCR: de punto final, en tiempo real y específica de metilación
- Secuenciación por bisulfito (directa y clonación)
- COBRA (Análisis de restricción de bisulfito combinado)
- Pirosecuenciación

El kit de conversión rápida de bisulfito EpiTect ofrece una conversión rápida y eficiente de ADN con bisulfito a partir de diversos materiales de partida, lo que es muy adecuado para todas las técnicas que se utilizan actualmente para el análisis de la metilación del ADN, entre ellas: