Qiagen, 59971, Kit EpiTect Hi-C (6)

Hi-C es un ensayo de ligación de proximidad que captura las interacciones de la cromatina a escala genómica. Puede utilizarse para la identificación de variantes estructurales*, reordenamientos cromosómicos y variaciones en el número de copias, el tamaño y la posición del centrómero de las copias cromosómicas, y el análisis epigenético.
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Características

- Kit todo incluido: reactivos de calidad controlada para generar bibliotecas NGS Hi-C
- Incluye adaptadores Illumina con códigos de barras de secuencia para secuenciación multiplexada
- Protocolo totalmente probado, robusto y rápido: generación de biblioteca Hi-C en <2 días
- Requerimientos bajos de entrada de muestra: bibliotecas generadas a partir de solo 5000 células
- Canalización de análisis de datos basada en herramientas de código abierto

Detalles del producto

La tecnología Hi-C es una técnica poderosa para la captura de la conformación cromosómica de todo el genoma que permite la caracterización del plegamiento de la cromatina con una resolución de kb.

El kit EpiTect Hi-C ofrece un protocolo robusto, pero simple y rápido, con bajos requisitos de entrada de células que permite la generación de bibliotecas NGS Hi-C Illumina de alta calidad a partir de células reticuladas en menos de 2 días.

Actuación

El kit EpiTect Hi-C genera bibliotecas NGS Hi-C de alta calidad, lo que garantiza la generación de datos de primera clase a partir de una costosa secuenciación profunda posterior. Se han analizado los resultados de secuenciación de más de 40 bibliotecas EpiTect Hi-C para evaluar el rendimiento del kit. Las métricas de control de calidad más importantes se muestran en las siguientes figuras: Porcentaje de eventos Hi-C, Porcentaje de interacciones cis de largo alcance, Relación Cis/Trans, Sin sesgo de orientación de cadena con el kit EpiTect Hi-C y Porcentaje de lecturas pareadas derivadas de un único fragmento de restricción. Los datos muestran que el kit EpiTect Hi-C genera bibliotecas NGS que, en promedio, superan con creces los criterios que normalmente se consideran suficientes para un experimento Hi-C exitoso.

Principio

Hi-C es un ensayo de ligadura de proximidad que captura las interacciones de la cromatina a escala de todo el genoma. El kit EpiTect Hi-C es una preparación de ADN especializada que da como resultado una biblioteca NGS compatible con Illumina (véanse las figuras Flujo de trabajo de EpiTect Hi-C: día 1 y Flujo de trabajo de EpiTect Hi-C: día 2). Descrito brevemente, el ensayo comienza con la purificación de núcleos en los que la conformación de la cromatina se ha congelado mediante la reticulación química de las proteínas de unión al ADN y el ADN. Luego, el ADN se digiere completamente con una enzima de restricción de 4 pb. Los extremos abiertos del ADN se marcan con biotina y posteriormente se ligan. La secuenciación de extremos emparejados de los productos de ligadura de Hi-C identifica un gran número de secuencias quiméricas que derivan de cadenas de ADN que estaban estrechamente asociadas en el espacio. La probabilidad de que dos secuencias se liguen entre sí es una función de su distancia promedio en el espacio. La cuantificación de las uniones de ligadura permite la determinación de las frecuencias de contacto del ADN a partir de las cuales se puede lograr un mapeo de alta resolución del plegamiento de la cromatina.

Procedimiento

El flujo de trabajo EpiTect Hi-C (véanse las figuras del flujo de trabajo EpiTect Hi-C - día 1 y del flujo de trabajo EpiTect Hi-C - día 2) representa una mejora notable con respecto a los protocolos publicados. Un procedimiento complejo y de una semana de duración se ha convertido en un protocolo sencillo y robusto que requiere tan solo 1,5 días. Además, el requisito de entrada de muestras se ha reducido en un orden de magnitud, lo que permite la creación de bibliotecas de NGS Hi-C a partir de tan solo 5000 células. El protocolo se ha desarrollado para trabajar con células entrecruzadas de cultivos celulares de mamíferos.

El procedimiento EpiTect Hi-C es una versión del método Hi-C in situ (es decir, en el núcleo), en el que los núcleos se purifican y permeabilizan suavemente para mantener la organización espacial del genoma durante los pasos iniciales de digestión y ligadura. Este proceso es vital para minimizar el ruido de fondo generado por eventos de ligadura no informativos que no reflejan la organización del genoma. Esto se debe a que los núcleos intactos limitan el movimiento y las colisiones aleatorias de los complejos entrecruzados, de modo que los eventos de ligadura ocurren predominantemente entre fragmentos de ADN topológicamente asociados.

Construcción de bibliotecas NGS Hi-C

El flujo de trabajo del kit EpiTect Hi-C consta de dos partes, cada una de las cuales puede completarse en un día. Los pasos del protocolo se resumen en las tablas a continuación y se visualizan en las figuras: flujo de trabajo EpiTect Hi-C (día 1) y flujo de trabajo EpiTect Hi-C (día 2). Los adaptadores Illumina incluidos tienen códigos de barras de secuencia que permiten la secuenciación multiplex de hasta 6 muestras.

Para ver el protocolo completo, consulte nuestro Manual detallado de EpiTect Hi-C.

Análisis de datos

El análisis de datos Hi-C se ofrece en nuestro Centro de Análisis de Datos GeneGlobe. Los resultados de secuenciación Hi-C pueden analizarse mediante el Portal de Análisis de Datos Hi-C de EpiTect, que utiliza herramientas de código abierto para generar un informe de secuenciación de control de calidad, matrices de contacto Hi-C y visualización de mapas de contacto de cromatina. Para más información, consulte nuestra Guía del usuario del Portal de Análisis de Datos Hi-C de EpiTect.

Phase Genomics, Inc. ofrece un conjunto completo de servicios de análisis computacional para el análisis de datos Hi-C, utilizando software de código abierto y propietario. Los servicios incluyen control de calidad de datos, cálculo y visualización de matrices Hi-C, identificación de características arquitectónicas como compartimentos A/B, TAD y bucles, análisis de variación estructural, ensamblaje genómico y determinación de fases de haplotipos, y otros análisis personalizados. Puede encontrar una descripción más detallada de las opciones analíticas en phasegenomics.com y una lista de publicaciones en Publicaciones y Noticias.

Aplicaciones

Conformación de la cromatina

La organización tridimensional de la cromatina se encuentra bajo intensa investigación debido a su profunda influencia en la función genómica. Al permitir la captura de contactos de ADN de largo alcance a escala genómica, Hi-C se ha convertido rápidamente en una herramienta muy importante para el análisis de la organización nuclear. El análisis de los datos de Hi-C ha revelado la asombrosa complejidad de la arquitectura genómica, con múltiples capas de organización espacial que dividen el genoma en territorios cromosómicos, subcompartimentos cromosómicos, dominios topológicamente asociados (TAD) y bucles de ADN con una resolución creciente (véase la figura Niveles de organización de la cromatina). Además, la organización genómica es dinámica y cambia durante el desarrollo. En ningún tipo de célula los cromosomas se pliegan de la misma manera.

La tecnología Hi-C está refinando nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de la regulación génica al demostrar el papel crucial que desempeña el plegamiento de la cromatina. Por ejemplo, los datos de Hi-C han proporcionado evidencia experimental contundente y concreta que respalda la creencia, arraigada, de que los potenciadores y promotores cognados se unen en el espacio mediante bucles de ADN, lo que explica cómo los elementos reguladores pueden controlar la expresión génica a lo largo de grandes distancias de la secuencia genómica. Además, los datos de Hi-C han revelado que el plegamiento de la cromatina ayuda a establecer compartimentos nucleares separados con entornos reguladores distintos al agrupar, en el espacio, dominios de ADN distales en secuencia, pero que comparten el mismo conjunto de marcas epigenéticas. Cabe destacar que los datos de Hi-C también revelan cómo las mutaciones que causan cambios sutiles en la estructura de la cromatina pueden alterar drásticamente la expresión génica y causar enfermedades.