Qiagen, 74524, Minikit de protección bacteriana RNeasy (50)

Kit RNeasy Mini (50) y reactivo para bacterias RNAprotect (2 x 100 ml)

Características

- Inmediato en la estabilización y protección del ARN.
- Datos fiables sobre expresión genética y perfiles genéticos
- No necesita nitrógeno líquido, hielo seco ni fenol.
- ARN total de alta calidad, listo para usar en minutos
- Sin gradientes de CsCl, sin precipitación de LiCl o etanol

Detalles del producto

Los minikits RNeasy Protect permiten la estabilización del ARN en muestras de tejido, ARN y ADN en células clasificadas o cultivadas, ARN en muestras de saliva humana y ARN en muestras bacterianas. El minikit RNeasy Protect y el minikit Bacteria incluyen columnas de centrifugación RNeasy para purificar hasta 100 µg de ARN de alta calidad mediante tecnología de membrana de sílice. El minikit RNeasy Protect Cell incluye el minikit RNeasy Plus para la purificación de ARN total. El minikit RNeasy Protect Saliva incluye el microkit RNeasy, que purifica y concentra el ARN total mediante columnas de centrifugación especializadas RNeasy MinElute.

Los kits RNeasy Protect Mini, RNeasy Protect Cell Mini y RNeasy Protect Bacteria Mini se pueden automatizar en QIAcube Connect.

Actuación

Tejido de ratón: Cantidad (mg)
Cerebro: 10
Hígado: 10
Pulmón: 10
Bazo: 10

Resultado del ensayo: reactivo celular RNAprotect
Rendimiento de ARN utilizando la tecnología RNeasy (µg): 10
RT-PCR en tiempo real de abl (valor CT): 25

Condiciones de almacenamiento celular: valor RIN del ARN purificado*
30ºC (1 día): 9,8
25ºC (7 días): 9,7
2–8ºC (28 días): 10
–20ºC (28 días): 9,8
–80ºC (28 días): 9,8

Las propiedades estabilizadoras del ARN del reactivo tisular RNAprotect previenen la inducción o la regulación negativa de genes provocada por la manipulación de muestras, lo que permite preservar y analizar el perfil de expresión génica. El conjunto RNeasy y RNAprotect permite el aislamiento de ARN de alta calidad (véase la figura "Prevención de la degradación del ARNm en tejidos"). Además, el ARN purificado por RNeasy a partir de muestras estabilizadas con RNAprotect permanece intacto tras el almacenamiento de las muestras de tejido en diversas condiciones (véase la figura "ARN estable en tejidos"). Se puede procesar una amplia gama de tipos de tejido con el minikit RNeasy Protect (véase la tabla "Rendimiento total de ARN obtenido con el minikit RNeasy Protect").

Rendimientos totales de ARN obtenidos con el kit RNeasy Protect Mini

El kit RNeasy Protect Cell Mini es ideal para experimentos de análisis de expresión genética en los que es necesario enviar células de un laboratorio a otro (consulte la tabla “Mayores rendimientos de ARN de leucocitos* conservados durante 10 días en el reactivo celular RNAprotect”).

Mayores rendimientos de ARN a partir de leucocitos* conservados durante 10 días en el reactivo celular RNAprotect

Las células en RNAprotect Cell Reagent se pueden almacenar o transportar hasta 1 día a 30 ºC, hasta 7 días a temperatura ambiente (15–25 ºC) o hasta 4 semanas a 2–8 ºC, y también se pueden almacenar a largo plazo a –20 ºC o –80 ºC (consulte la tabla “ARN intacto de células Jurkat almacenado a temperatura ambiente” y las figuras “Inhibición efectiva de la inducción de PMA” y “Cuantificación más fiable de la transcripción de CD83”), lo que le permite preservar y analizar el perfil de expresión génica.

ARN intacto de células Jurkat almacenado a temperatura ambiente

La saliva estabilizada con el reactivo de saliva RNAprotect puede almacenarse o transportarse hasta un día a 37 °C, hasta 14 días a temperatura ambiente (15-25 °C) o hasta 4 semanas a 2-8 °C, o bien archivarse a –20 °C o –80 °C (véase la figura "Estabilización eficaz del transcrito de β-actina"), lo que permite preservar y analizar el perfil de expresión génica. El ARN purificado de la saliva, como alternativa a la sangre, permite el análisis de microarrays para la investigación de enfermedades orales y sistémicas, y el análisis de la expresión génica de biomarcadores de ARN para el cáncer mediante RT-PCR en tiempo real (véanse las figuras "Minimización de la degradación del transcrito en la saliva" y "Niveles estables de ARNm de biomarcadores de cáncer").

Durante los métodos tradicionales de recolección de células y aislamiento de ARN, la degradación enzimática del ARN provoca la reducción o pérdida de numerosos transcritos. Esta reducción es especialmente significativa en las moléculas de ARNm bacterianas, cuyas vidas medias son muy cortas, de tan solo unos minutos. Además, durante la manipulación y el procesamiento de muestras bacterianas, se pueden inducir genes, lo que aumenta su expresión. El uso del reactivo RNAprotect Bacteria soluciona estos problemas al proporcionar una estabilización inmediata antes del aislamiento del ARN (véanse las figuras "El reactivo RNAprotect Bacteria previene la degradación del ARNm" y "Perfiles precisos de expresión génica"), lo que permite preservar y analizar el perfil de expresión génica. El rendimiento de E. coli (6 x 10⁻¹ células) es de 100 µg de ARN y el de Bacillus subtilis (1 x 10⁻¹ células) es de 15 µg. El ARN purificado con el kit es de alta calidad con proporciones A2 60 /A 280 de 1,9–2,1 (medidas en 10 mM Tris·Cl, pH 7,5).

El ARN purificado con la tecnología RNeasy presenta ratios A₂₆/A₂₆ de 1,9 a 2,1 (medidos en Tris·Cl 10 mM, pH 7,5). Dado que el procedimiento RNeasy enriquece especies de ARN >200 nt, el ARN obtenido no incluye ARNr 5S, ARNt ni otros ARN de bajo peso molecular.

Principio

El sistema RNeasy Protect, compuesto por el paquete RNeasy y RNAprotect, ofrece una solución completa de protección y aislamiento de ARN, desde la recolección de la muestra hasta la obtención de ARN puro, en un solo kit. La probada tecnología de membrana de sílice RNeasy en formato de columna de centrifugación, combinada con las propiedades estabilizadoras de ARN de los reactivos RNAprotect, permite la purificación de ARN intacto de alta calidad. Una vez recolectada una muestra biológica, su ARN se vuelve extremadamente inestable (véase la figura "Cambios en los niveles de ARNm"). Los innovadores reactivos RNAprotect estabilizan y protegen inmediatamente el patrón de expresión del ARN. Las muestras pueden archivarse sin riesgo de degradación del ARN, incluso después de múltiples ciclos de congelación y descongelación. Tras la estabilización, la tecnología RNeasy simplifica el aislamiento total del ARN al combinar la rigurosidad de la lisis con isotiocianato de guanidina con la velocidad y pureza de la purificación con membrana de sílice (véase la figura "Columna de centrifugación RNeasy Mini").

Procedimiento

Las muestras se pueden estabilizar y almacenar en el reactivo tisular RNAprotect, incluido en los kits RNeasy Protect. Para la purificación del ARN, las muestras (0,5–30 mg de tejido) se lisan primero y luego se homogeneizan. Se añade etanol al lisado para lograr las condiciones ideales de unión. A continuación, el lisado se carga en la membrana de sílice RNeasy (capacidad de unión de hasta 100 µg de ARN). El ARN se une y todos los contaminantes se eliminan eficazmente. El ARN puro y concentrado se eluye en 30–100 µl de agua (véase el diagrama de flujo "Procedimiento RNeasy Protect Mini"). La purificación del ARN se puede automatizar en QIAcube Connect.

Las células clasificadas o cultivadas se mezclan con el reactivo celular RNAprotect, que estabiliza inmediatamente el ARN celular. Tras la estabilización del ARN, el ARN total se purifica con el minikit RNeasy Plus (véase el diagrama de flujo "Procedimiento de RNeasy Protect Cell"). Las células en el reactivo celular RNAprotect se centrifugan y el sedimento celular resultante se lisa y homogeneiza en tampón RLT Plus. A continuación, el lisado se pasa por una columna de centrifugación gDNA Eliminator, que elimina el ADN genómico de forma rápida y eficaz. Se añade etanol al lisado, que se aplica a una columna de centrifugación RNeasy. Tras la centrifugación, el ARN total se une a la membrana de la columna de centrifugación RNeasy. Los contaminantes se eliminan eficazmente y el ARN total de alta calidad se eluye en 30-50 µl de agua sin ARNasa. La purificación de ADN, o de ARN y ADN, requiere la compra adicional de un kit de purificación de ADN de QIAGEN. Se proporcionan detalles en el Manual del reactivo celular RNAprotect.

La saliva (200 µl) obtenida de un donante se mezcla inmediatamente con el reactivo de saliva RNAprotect para estabilizar el ARN en la saliva. El ARN total se purifica a partir de la saliva estabilizada utilizando el kit RNeasy Micro (véase el diagrama de flujo "Procedimiento de RNeasy Protect Saliva"). La muestra de saliva se centrifuga primero y, a continuación, se añade el tampón RLT al sedimento resultante. Tras añadir etanol, la muestra se aplica a una columna de centrifugación RNeasy MinElute, donde el ARN se une a la membrana tras la centrifugación. Las trazas de ADN genómico se eliminan mediante digestión con DNasa y los contaminantes se eliminan mediante varios pasos de lavado. El ARN de alta pureza se eluye posteriormente con agua sin RNasa en un volumen de tan solo 14 µl. El reactivo de saliva RNAprotect también estabiliza el ADN. Existen protocolos para la purificación de ADN, o de ARN y ADN, a partir de saliva estabilizada.

Se añaden dos volúmenes del reactivo RNAprotect Bacteria directamente a un volumen de cultivo bacteriano (≤7,5 x 10⁻¹ bacterias) antes del aislamiento del ARN, lo que proporciona una estabilización inmediata del ARN (véase el diagrama de flujo "Procedimiento del reactivo RNAprotect Bacteria"). Esta estabilización permite una lisis bacteriana eficiente mediante diferentes protocolos: lisis enzimática, disrupción mecánica o una combinación de ambos. Recomendamos el TissueLyser II para una disrupción mecánica eficiente. A continuación, se añade etanol al lisado para proporcionar las condiciones de unión ideales. El lisado se carga en la membrana de sílice RNeasy (capacidad de unión de 100 µg de ARN). Tras la unión del ARN, todos los contaminantes se eliminan eficazmente por lavado. El ARN puro y concentrado se eluye en 30–100 µl de agua. El minikit RNeasy Protect Bacteria puede automatizarse en QIAcube Connect.

Las cantidades de ARN aisladas de bacterias pueden variar según la especie y las condiciones de crecimiento. El minikit RNeasy Protect Bacteria es adecuado para su uso con una amplia gama de especies bacterianas, tanto Gram positivas (p. ej., Staphylococcus aureus y Mycobacterium avium) como Gram negativas (p. ej., Escherichia coli y Salmonella typhimurium). Se pueden utilizar bacterias cultivadas en medio mínimo o complejo. Dado que el procedimiento RNeasy enriquece con especies de ARN >200 nucleótidos, el rendimiento de ARN no incluye ARNr 5S, ARNt u otros ARN de bajo peso molecular. Los kits RNeasy Protect Bacteria proporcionan ARN de la más alta calidad con una copurificación mínima de ADN. Para ciertas aplicaciones de ARN sensibles a cantidades muy pequeñas de ADN, las cantidades residuales de ADN remanentes se pueden eliminar utilizando el juego de ADNasa sin ARNasa para un cómodo tratamiento con ADNasa en columna durante el procedimiento RNeasy.

Aplicaciones

- Secuenciación de ARN
- RT-PCR cuantitativa en tiempo real
- RT-PCR de punto final
- Transferencia Northern, por puntos y por ranuras
- Análisis de matrices
- Selección de ARN poli A+

El ARN purificado con la tecnología RNeasy es ideal para todo tipo de aplicaciones. Entre las aplicaciones posteriores se incluyen: