Qiagen, 762164, Kit de ARN sanguíneo PAXgene (IVD) (50)

50 columnas de centrifugación PAXgene, 50 columnas de centrifugación PAXgene Shredder, tubos de procesamiento, DNasa I sin ARNasa, reactivos y tampones sin ARNasa. Para usar junto con los tubos de ARN sanguíneo PAXgene.

Características

- Para diagnóstico in vitro, con tubos de ARN sanguíneo PAXgene
- Sistema integrado de recolección, estabilización y purificación.
- Estabilización del ARN hasta 3 días a 18–25 °C
- Estabilización durante al menos 60 meses a –20°C o –70°C
- Procesamiento estandarizado de muestras antes del análisis
- La purificación se puede automatizar en QIAcube Connect MDx*

Detalles del producto

El sistema PAXgene Blood RNA consta de tubos PAXgene Blood RNA (disponibles en BD, n.º de cat. 762165) para la extracción, estabilización y transporte de sangre, y el kit PAXgene Blood RNA para el aislamiento y purificación de ARN con membrana de sílice en formato de columna de centrifugación. La purificación puede realizarse manualmente, mediante una microcentrífuga, o automatizada en el QIAcube Connect MDx. El sistema cuenta con la autorización de comercialización de la FDA y ofrece especificaciones de rendimiento precisas para su uso en diagnóstico in vitro.

Actuación

Sistema de prueba: ensayo de ARNr FOS/18S
Comparación de datos: Media
(ΔΔC T ): (ΔΔC T )
Reproducibilidad dentro de cada usuario y entre todos los lotes
Todos los usuarios, lote 1 – lote 1: 0,00
Todos los usuarios, lote 1 – lote 2: –0,03
Todos los usuarios, lote 1 – lote 3: –0,21
Reproducibilidad dentro de cada lote y entre todos los usuarios
Todos los lotes, usuario A – usuario A: 0,00
Todos los lotes, usuario A – usuario B: –0,46
Todos los lotes, usuario A – usuario C: –0,31

Los tubos PAXgene Blood RNA están diseñados para la recolección de sangre completa y la estabilización del ARN intracelular durante un máximo de 3 días a 18-25 °C (véanse las figuras «Estabilidad del ARN a 18-25 °C: FOS» y «Estabilidad del ARN a 18-25 °C: IL1B») o hasta 5 días a 2-8 °C (véanse las figuras «Estabilidad del ARN a 2-8 °C: FOS» y «Estabilidad del ARN a 2-8 °C: IL1B»). Los datos disponibles actualmente muestran una estabilización del ARN celular durante al menos 60 meses a –20 °C o –70 °C.

El ARN total purificado con el sistema PAXgene Blood RNA System presenta una alta pureza, con valores de A260/A280 entre 1,8 y 2,2, y ≤1,0 % (p/p) de ADN genómico. Al menos el 95 % de las muestras no presentan inhibición en la RT-PCR, utilizando hasta el 30 % del eluido.

El tiempo promedio de preparación de muestras (basado en datos de 12 preparaciones) es de aproximadamente 90 minutos, con solo 40 minutos de tiempo de práctica. La producción de ARN a partir de 2,5 ml de sangre humana sana es ≥3 µg para ≥95% de las muestras procesadas. Dado que la producción depende en gran medida del donante, la producción individual puede variar. Para cada donante, el sistema de ARN sanguíneo PAXgene ofrece una producción altamente reproducible y repetible (véanse las figuras "Purificación de ARN reproducible y repetible" y "Repetibilidad y reproducibilidad de la producción de ARN"), así como una RT-PCR reproducible y repetible (véanse las figuras "Reproducibilidad entre usuarios" y "Reproducibilidad entre lotes de kits" y la tabla), lo que lo hace muy robusto para pruebas de diagnóstico clínico.

La producción de ARN a partir de 2,5 ml de sangre humana completa sana es ≥3 μg para ≥95 % de las muestras procesadas. La figura "Producción y pureza del ARN — procesamiento automatizado" indica la producción de ARN de un total de 288 muestras preparadas mediante el protocolo automatizado con 3 lotes de kit por 3 operadores. Dado que para estos estudios se utilizaron muestras de sangre agrupadas en lugar de tubos PAXgene Blood RNA individuales, los resultados no reflejan la producción de ARN esperada a partir de muestras individuales de sangre extraída. Dado que la producción depende en gran medida del donante, la producción individual puede variar.

Al menos el 95 % de las muestras no presentan inhibición en la RT-PCR, utilizando hasta el 30 % del eluido. Con el protocolo automatizado, la contaminación cruzada entre muestras es indetectable, medida mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real de las secuencias de los transcritos de betaglobina y FOS en muestras ARN-negativas (agua) emparejadas con muestras ARN-positivas (sangre humana completa) en la misma serie.

El ARN purificado con el sistema PAXgene Blood RNA y el protocolo automatizado presenta una alta pureza, como lo demuestra la ausencia de inhibición por RT-PCR (véase más arriba) y valores de A260/A280 entre 1,8 y 2,2. El ADN genómico está presente en ≤1 % (p/p) en ≥95 % de todas las muestras, según lo medido mediante PCR cuantitativa en tiempo real de una secuencia del gen de la beta-actina. La figura "Rendimiento y pureza del ARN — procesamiento automatizado" muestra los valores de A260/A280 y el ADN genómico relativo de un total de 288 muestras preparadas mediante el protocolo automatizado con 3 lotes de kit por 3 operadores.

El protocolo automatizado de purificación de ARN utilizando el sistema de ARN sanguíneo PAXgene proporciona resultados de RT-PCR altamente reproducibles y repetibles, como se muestra en la figura "Reproducibilidad entre protocolos automatizados y manuales", lo que lo hace altamente robusto para pruebas de diagnóstico clínico.

Usuario: Técnico que realizó el estudio. Lote: Número de lote del kit utilizado en este estudio. DE: Desviación estándar. Los valores medios de ΔΔCT (N = 120) y las desviaciones estándar se muestran para los datos presentados en las figuras "Reproducibilidad entre usuarios" y "Reproducibilidad entre lotes del kit".

Principio

El kit PAXgene Blood RNA permite la purificación del ARN total de 2,5 ml de sangre humana completa recolectada en un tubo PAXgene Blood RNA. El procedimiento es sencillo y puede realizarse de forma manual o automatizada (consulte los diagramas de flujo «Procedimiento manual de PAXgene Blood RNA» y «Procedimiento automatizado de PAXgene Blood RNA»).

Los tubos PAXgene para ARN en sangre contienen una composición de reactivo patentada basada en una tecnología de estabilización de ARN (patentes estadounidenses 6.602.718 y 6.617.170). Esta composición protege las moléculas de ARN de la degradación por ARNasas y minimiza los cambios ex vivo en la expresión génica. Los tubos PAXgene para ARN en sangre están diseñados para la recolección de sangre completa y la estabilización del ARN intracelular durante un máximo de 3 días a 18-25 °C (véanse las figuras «Estabilidad del ARN a 18-25 °C: FOS» y «Estabilidad del ARN a 18-25 °C: IL1B») o hasta 5 días a 2-8 °C (véanse las figuras «Estabilidad del ARN a 2-8 °C: FOS» y «Estabilidad del ARN a 2-8 °C: IL1B»). Los datos disponibles actualmente muestran una estabilización del ARN celular durante al menos 60 meses a –20 °C o –70 °C.

Procedimiento

El procedimiento de ARN de sangre PAXgene es sencillo y se puede realizar mediante procedimientos manuales o automatizados (consulte los diagramas de flujo "Procedimiento manual de ARN de sangre PAXgene" y "Procedimiento automatizado de ARN de sangre PAXgene").

Procedimiento manual de purificación de ARN sanguíneo PAXgene. La purificación comienza con una centrifugación para sedimentar los ácidos nucleicos en el tubo PAXgene Blood RNA. El sedimento se lava, se resuspende y se incuba en tampones optimizados junto con proteinasa K para digerir las proteínas. Se realiza una centrifugación adicional a través de la columna de centrifugación PAXgene Shredder para homogeneizar el lisado celular y eliminar los restos celulares. El sobrenadante de la fracción de flujo se transfiere a un tubo de microcentrífuga limpio. Se añade etanol para ajustar las condiciones de unión y el lisado se aplica a una columna de centrifugación PAXgene RNA. Durante una breve centrifugación, el ARN se une selectivamente a la membrana de sílice PAXgene a medida que los contaminantes pasan a través de ella. Los contaminantes restantes se eliminan en varios lavados eficientes. Entre el primer y el segundo lavado, la membrana se trata con DNasa I para eliminar trazas de ADN unido. Después del lavado, el ARN se eluye en tampón de elución y se desnaturaliza por calor.

Procedimiento automatizado de ARN sanguíneo PAXgene La preparación de muestras, automatizada en QIAcube Connect MDx, sigue los mismos pasos que el procedimiento manual, lo que le permite seguir utilizando el kit de ARN sanguíneo PAXgene para la purificación de ARN de alta calidad.

El protocolo de purificación automatizada de ARN consta de 2 partes (o protocolos), "PAXgene Blood RNA Part A" y "PAXgene Blood RNA Part B", con una breve intervención manual entre las 2 partes.

El pellet de ácido nucleico centrifugado, lavado y resuspendido se transfiere del tubo PAXgene Blood RNA a los tubos de procesamiento, que se colocan en el termoagitador de la mesa de trabajo QIAcube Connect MDx. El operador selecciona e inicia el protocolo "PAXgene Blood RNA Parte A" en el menú. El QIAcube Connect MDx ejecuta los pasos del protocolo hasta la elución del ARN en el tampón de elución. El operador transfiere los tubos de microcentrífuga que contienen el ARN purificado al termoagitador del QIAcube Connect MDx. El operador selecciona e inicia el protocolo "PAXgene Blood RNA Parte B" en el menú, y el QIAcube realiza la desnaturalización térmica.

El tiempo promedio de preparación de muestras (basado en datos de 12 preparaciones de muestras) es de 151 minutos, con solo aproximadamente 20 minutos de tiempo práctico.

Aplicaciones

Cuando el kit se utiliza junto con los tubos de ARN sanguíneo PAXgene, el sistema proporciona ARN intracelular de sangre completa para RT-PCR utilizada en pruebas de diagnóstico molecular.