Qiagen, 969261, kit de biorobot Ni-NTA Superflow 96 (4)

Para 4 x 96 preparaciones de proteínas etiquetadas con 6xHis: 4 placas QIAfilter 96, 4 placas TurboFilter 96, 1 ​​x 100 ml Ni-NTA Superflow

Características

- Purificación totalmente automatizada de hasta 2 mg de proteína por pocillo
- Proteína de alta pureza libre de contaminación cruzada.
- Purificación en condiciones nativas o desnaturalizantes

Detalles del producto

El kit Ni-NTA Superflow 96 BioRobot permite la purificación automatizada de hasta 300 µg de proteína recombinante de 96 muestras en paralelo (protocolo estándar, 5 ml de volumen de cultivo por muestra). Los lisados ​​celulares bacterianos clarificados fluyen hacia una placa de filtro precargada con Ni-NTA Superflow por la estación de trabajo BioRobot. Este exclusivo módulo de cromatografía de afinidad con quelatos metálicos de 96 pocillos se une de forma potente y selectiva a las proteínas marcadas con His. Se proporcionan protocolos listos para usar para la purificación en condiciones nativas o desnaturalizadas.

Actuación

Proteína marcada con His: Rendimiento total por pocillo (µg)*
Proteína fluorescente verde: 4000
ARN polimerasa T7: 1000
GroES: 300
Cloranfenicol acetiltransferasa: 2400
GroEL: 740
Factor de necrosis tumoral α: 1600
GroES/GroEL: 1200
Cpn-10: 170

En respuesta a las necesidades de los clientes de mayores cantidades de proteína a partir de procedimientos automatizados, QIAGEN ha adaptado el protocolo Ni-NTA Superflow 96 BioRobot para permitir el procesamiento de mayores volúmenes de cultivo y la purificación de cantidades de hasta 2 mg de proteína marcada con His por pocillo. El aumento de la cantidad de resina Ni-NTA Superflow utilizada en el procedimiento a 200 µl por pocillo y una formulación optimizada del tampón de lisis permite procesar cultivos de hasta 25 ml (purificación en condiciones nativas) o 15 ml (purificación en condiciones desnaturalizantes) (protocolos de alto rendimiento). Los cultivos celulares se transfieren a bloques de 24 pocillos para su procesamiento. El aumento correspondiente en la biomasa puede proporcionar un mayor rendimiento de proteína marcada con His pura por pocillo (consulte la tabla y la figura Cantidades en miligramos de proteínas marcadas con His por pocillo) que permiten realizar múltiples ensayos en el mismo lote de proteína y reducir el número total de preparaciones de proteína necesarias, consulte también la figura Cribado automatizado de clones de expresión. La purificación en un solo paso proporciona proteínas altamente puras en un amplio rango de rendimientos y es posible la purificación de grandes complejos de proteínas.

Principio

El sistema de purificación de proteínas QIA express Ni-NTA, que incluye el kit Ni-NTA Superflow 96 BioRobot, se basa en la notable selectividad de la resina patentada Ni-NTA (ácido nitrilotriacético de níquel) para proteínas que contienen una etiqueta de afinidad de seis o más residuos de histidina: la etiqueta His. Esta tecnología permite la purificación en un solo paso de prácticamente cualquier proteína marcada con His de cualquier sistema de expresión, tanto en condiciones nativas como desnaturalizadas. El NTA, que cuenta con cuatro sitios de quelación para iones de níquel, se une al níquel con mayor fuerza que los sistemas de purificación quelantes de metales, que solo disponen de tres sitios disponibles para la interacción con iones metálicos. El sitio de quelación adicional evita la lixiviación de iones de níquel y produce una mayor capacidad de unión y preparaciones de proteínas con mayor pureza que las obtenidas con otros sistemas de purificación quelantes de metales. El sistema QIA express puede utilizarse para purificar proteínas marcadas con His de cualquier sistema de expresión, incluyendo baculovirus, células de mamíferos, levaduras y bacterias. (Ver figura Purificación de proteínas con el sistema de purificación de proteínas Ni-NTA).

Procedimiento

Desnaturalizantes: Detergentes
6 M Gu·HCl: 2 % Tritón X-100
8 M de urea: 2 % de Tween 20
1% CHAPS: 20 mM TCEP

La purificación de proteínas marcadas con His consta de 4 etapas: lisis celular, unión, lavado y elución y es la base del kit Ni-NTA Superflow BioRobot (ver figura Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit). La purificación de proteínas recombinantes utilizando el sistema QIA express no depende de la estructura tridimensional de la proteína o la etiqueta 6xHis. Esto permite la purificación de proteínas en un solo paso en condiciones nativas o desnaturalizantes, a partir de soluciones diluidas y lisados ​​​​crudos. Se pueden utilizar desnaturalizantes y detergentes fuertes para una solubilización y purificación eficientes de receptores, proteínas de membrana y proteínas que forman cuerpos de inclusión. Los reactivos que permiten la eliminación eficiente de contaminantes de unión inespecífica se pueden incluir en los tampones de lavado (ver tabla). Las proteínas purificadas se eluyen en condiciones suaves agregando 100–250 mM de imidazol como competidor o mediante una reducción del pH.

El kit Ni-NTA Superflow 96 BioRobot está diseñado para usarse con estaciones de trabajo BioRobot 3000, 8000 o 9600.

Aplicaciones

- Investigaciones estructurales y funcionales
- Cristalización para la determinación de la estructura tridimensional
- Ensayos que involucran interacciones proteína-proteína y proteína-ADN
- Inmunización para producir anticuerpos

El sistema de purificación de proteínas Ni-NTA QIA express proporciona una purificación confiable en un solo paso de proteínas adecuadas para muchas aplicaciones, entre ellas: