Qiagen, EN11-050, T4 ADN ligasa MBG (500 U)

100 μL de ADN ligasa T4 5 U/μL, 200 μL de tampón de ligación T4 10x, 80 μL de solución de ATP (25 mM), 200 μL de solución de PEG al 50%. Temperatura de almacenamiento: Mantener a -20 °C.

Características

- Cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos yuxtapuestos de 5'-fosfato y 3'-hidroxilo.
- Exhibe una ligadura muy rápida y eficiente de fragmentos de ADN con extremos cohesivos o romos compatibles.

Detalles del producto

La ADN ligasa T4 MBG es una enzima recombinante dependiente de ATP, aislada de una cepa de Escherichia coli, que se utiliza para clonar ADN. La ADN ligasa T4 cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5'-fosfato y 3'-hidroxilo yuxtapuestos en ADN o ARN dúplex. Une fragmentos de restricción de ADN, tanto romos como cohesivos, y repara mellas monocatenarias en ADN, ARN o híbridos ADN/ARN dúplex.

Se suministra con 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 mM EDTA, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 50% (v/v) glicerol.

Una unidad (Weiss) de ADN ligasa T4 cataliza la conversión de 1 nmol de 32P de pirofosfato a material adsorbible por Norit en 30 minutos a 37 °C. Una unidad Weiss equivale aproximadamente a 200 unidades cohesivas terminales.

Actuación

Ensayo: Especificación
Contaminación por DNasa: No se detectó ninguna
Actividad de exonucleasa: No se detectó ninguna
Actividad de endonucleasa: No se detectó ninguna

Principio

- El tampón de ligadura 10x y la solución de ATP deben descongelarse y resuspenderse a temperatura ambiente.
- Para ligaduras de extremos romos, utilice mayores cantidades tanto del vector como del ADN insertado.
- Para ligaduras de extremos cohesivos pegajosos, recomendamos calentar tanto el vector como el ADN insertado antes de la ligadura.
- La eficiencia de la electrotransformación se puede mejorar mediante la inactivación térmica de la ADN ligasa T4 MBG y la purificación del ADN a través de un método de purificación en columna de centrifugación.
- Recomendamos utilizar un exceso molar de 3 a 10 de ADN de inserción sobre el ADN del vector.
- La enzima se inhibe a concentraciones de NaCl o KCl >200 mM.
- Inactivar la enzima a 65°C durante 10 minutos o a 70°C durante 5 minutos.

La ADN ligasa T4 cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5'-fosfato y 3'-hidroxilo yuxtapuestos en ADN o ARN dúplex. Une fragmentos de restricción de ADN con extremos romos y cohesivos y repara mellas monocatenarias en ADN, ARN o híbridos ADN/ARN dúplex.

Procedimiento

Control de calidad

La actividad de la ADN ligasa T4 se analiza en una reacción que contiene 1 µg de ADN del bacteriófago lambda digerido con HindIII, tampón de ligación T4 1x y cantidades variables de enzima durante 20 minutos a 16 °C. Los resultados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto está libre de nucleasas de ADN inespecíficas.

Las actividades de exonucleasa y endonucleasa se evaluaron mediante electroforesis en gel después de la incubación de 1 µg de ADN con enzima en un volumen de 50 µL durante 4 horas a 37 °C.

Aplicaciones

- Clonación molecular de productos de PCR o fragmentos de restricción
- Mutagénesis dirigida al sitio
- Reparación de mellas en ADN dúplex, ARN o híbridos ADN/ARN
- Autocircularización del ADN lineal
- Métodos de PCR LM (PCR mediada por ligadura)

Esto se utiliza para aplicaciones como: