Qiagen, EN13-B, ADN ligasa Tth (5000 U)

1000 μL de ADN ligasa Tth 5 U/μL, 2500 μL de tampón de ligadura Tth 10x. Temperatura de almacenamiento: Mantener a -20 °C. Hasta 20 ciclos de descongelación no afectarán el rendimiento del tampón de ligadura Tth 10x.

Características

- Presenta una alta termoestabilidad que permite la ligadura utilizando condiciones de hibridación de alta rigurosidad.
- Posee alta especificidad y rigurosidad que permiten la detección sensible de SNP.

Detalles del producto

La ADN ligasa Tth cataliza la formación de enlaces fosfodiéster, dependiente de NAD, entre los extremos adyacentes 3'-hidroxilo y 5'-fosfato del ADN bicatenario. No es activa contra el ADN o ARN monocatenario ni contra el ADN de extremos romos. La enzima se aísla de la cepa de Escherichia coli que contiene un plásmido portador del gen de la ADN ligasa de Thermus thermophilus.

Se suministra con 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 1 mM DTT, 50% glicerol.

Una unidad de ADN ligasa Tth cataliza la ligación del 50 % de los sitios cos presentes en 1 μg de ADN del bacteriófago lambda en 1 minuto a 45 °C. Una unidad de ADN ligasa Tth equivale a 15 unidades cohesivas terminales (CEU).

Actuación

Ensayo: Especificación
Actividad de la ligasa: Aprobada
Contaminación por DNasa: No se detectó ninguna
Actividad de exonucleasa: No se detectó ninguna
Actividad de endonucleasa: No se detectó ninguna

Principio

La ADN ligasa Tth es estable y activa en un rango óptimo de temperatura de ligación de 45 a 65 °C, que es de 7 a 10 °C más alto que el de la ADN ligasa T4. La Tm de los sustratos determina la temperatura de ligación final de la reacción. Una temperatura de ligación alta elimina la ligación inespecífica.

Procedimiento

Control de calidad

La actividad de la ADN ligasa Tth se analiza en una reacción que contiene 1 µg de ADN del bacteriófago lambda digerido con SalI y SmaI (ADN control), tampón de ligación Tth 1x y cantidades variables de enzima durante 100 minutos a 450 °C. Los resultados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto está libre de nucleasas de ADN inespecíficas. Los resultados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa tras la incubación de 1 µg de sustrato de ADN con 5 U de la enzima Tth ligasa durante 4 horas a 700 °C.

Aplicaciones

- Reacción en cadena de la ligasa (LCR)
- Reacción de detección de ligasa (LDR)
- Secuenciación de ADN de próxima generación (NGS)
- Detección de expansión repetida (RED)
- Amplificación de círculo rodante (RCA)
- Ensayo de ligadura de proximidad (PLA)

Esto se utiliza para aplicaciones como: