Qiagen, EN32-050, Saltonasa (5000 U)

20 µL x 250 U/µL. Temperatura de almacenamiento: -20 °C sin ciclo de descongelación; -80 °C para almacenamiento prolongado. Estable a -20 °C durante al menos 24 meses. No se observa pérdida de actividad hasta 6 semanas de incubación a 37 °C.

Características

- Grado de biología molecular (MBG) y grado de buenas prácticas de fabricación (GMP)
- Altamente activo en un amplio rango de temperaturas (>20% a 15–55 °C)
- Actividad nucleolítica máxima a altas concentraciones de sal (la concentración óptima para NaCl o KCl es 450–600 mM) y otros aditivos tampón
- Altamente activo en los buffers y medios de cultivo típicos.
- Requiere ≥1 mM de Mg 2+ para activarse y muestra un amplio espectro de actividad de pH (óptimo a pH 8,5, rango de pH de trabajo >con actividad enzimática ≥20% 6,8–9,3)

Detalles del producto

La saltonasa es una endonucleasa recombinante derivada de bacterias psicrofílicas y producida en E. coli. Presenta una alta actividad en un amplio rango de concentraciones de sal y pH, lo que la hace eficaz para digerir sustratos de ADN y ARN en diversas condiciones de tampón y temperaturas. La saltonasa muestra una actividad robusta en entornos difíciles, incluyendo aquellos con alto contenido de sal y un amplio rango de pH. Estas características la convierten en una herramienta invaluable para eliminar la contaminación no deseada de ácidos nucleicos durante los procesos de purificación de proteínas, tanto en el laboratorio como en la biofabricación.

Se suministra con 20 mM Tris (pH 7,1 a 25 °C), 620 mM NaCl, 26 mM MgCl 2 y 50 % (v/v) de glicerol.

Una unidad se define como un aumento de la absorbancia a 260 nm de 1,0 en 30 minutos a 37 °C en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 (25 °C) suplementado con NaCl 500 mM, MgCl 2 5 mM, 0,1 mg/ml de BSA y 0,5 mg/mL de ADN de esperma de arenque como sustrato.

Actuación

Saltonasa: Grado de Biología Molecular
Actividad: ≥250 U/µL
Pureza: ≥95 %
Pureza de proteínas: SDS-PAGE
Actividad de proteasa: No se detectó ninguna
Endotoxinas: No probadas
Carga biológica: no probada

Estructura de la cromatina: Viscosidad
El ADN se envuelve alrededor de las histonas Histonas con carga positiva y ADN con carga negativa: la concentración de NaCl de 500 mM reduce la viscosidad y aumenta el rendimiento del vector viral por la eliminación del ADN y la cromatina del huésped

- El ADN está envuelto alrededor de las histonas.
- Histonas con carga positiva y ADN con carga negativa

- La concentración de NaCl de 500 mM reduce la viscosidad y aumenta el rendimiento del vector viral mediante la eliminación del ADN y la cromatina del huésped.

- La agregación complica la producción y la purificación.
- Las altas concentraciones de sal en el tampón de lisis reducen la agregación del vector.

- Se utiliza una amplia gama de concentraciones de endonucleasas.
- Entre 1 y 1000 U/mL; inversión muy costosa

*Descargo de responsabilidad para fabricantes de medicamentos

"Grado GMP" es un término de marketing utilizado por QIAGEN para las enzimas fabricadas conforme a los estándares de calidad establecidos, como ISO 13485, US QSR (21 CFR 820) e ISO 9001. Estas enzimas son aptas para la industria biofarmacéutica, cumplen estrictos requisitos de pureza y no contienen materiales de origen animal (AOF) utilizados en los procesos de fabricación ni en el producto final. Se producen en una línea específica y con equipos que cumplen con los requisitos de AOF. Las enzimas "Grado GMP" no contienen antibióticos betalactámicos y presentan bajos niveles de endotoxinas y carga biológica. Al incorporarse en los procesos de fabricación de fármacos, se consideran "ingredientes inactivos" y no deben permanecer en el producto final. Es responsabilidad del cliente garantizar la seguridad y la conformidad del producto final, incluyendo el cumplimiento de todos los requisitos legales y reglamentarios pertinentes, así como verificar que las enzimas funcionen según lo especificado.

Si bien QIAGEN se adhiere a rigurosos sistemas de gestión de calidad como fabricante de dispositivos médicos, no produce ingredientes farmacéuticos activos (API) ni excipientes, ni cumple con las normas vigentes de Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) para productos farmacéuticos. El fabricante del medicamento es responsable de evaluar la idoneidad de las enzimas QIAGEN de "calidad GMP" en sus procesos de producción específicos y de garantizar el cumplimiento de todos los requisitos legales y reglamentarios aplicables. QIAGEN no ofrece ninguna declaración ni garantía, salvo lo establecido explícitamente en sus términos y condiciones de venta.

Principio

Desafíos en la biofabricación: la necesidad de una eliminación eficiente del ADN de las células huésped

La biofabricación, especialmente en la producción de vectores virales, enfrenta varios desafíos críticos para lograr una alta pureza y cumplir con los requisitos regulatorios. Una de las mayores preocupaciones es la eliminación del ADN de la célula huésped, que puede presentar riesgos como oncogenicidad e infecciosidad si se deja en el producto final. La estructura de la cromatina, donde el ADN está estrechamente unido a las histonas, crea barreras significativas para que las endonucleasas accedan al ADN y lo degraden eficientemente. Además, las altas concentraciones de ADN pueden aumentar la viscosidad de la solución, lo que dificulta la actividad enzimática, reduce la eficiencia del proceso y complica las etapas posteriores de purificación. Estos desafíos exigen soluciones altamente especializadas que no solo funcionen de forma consistente en diversas condiciones, sino que también mantengan una alta actividad para satisfacer las crecientes demandas de la industria biofarmacéutica.

El papel de la sal en la lisis celular y la reducción de la viscosidad.

La sal es crucial para optimizar la lisis celular y mejorar la producción de vectores virales. Si bien muchos bioprocesos dependen de concentraciones fisiológicas de sal, la purificación de vectores virales suele beneficiarse del uso de altas concentraciones de sal durante la lisis celular. La sal ayuda a reducir la agregación de partículas virales, lo que garantiza un mayor rendimiento del producto. Ayuda a reducir la viscosidad creada por el ADN liberado, lo que permite que las endonucleasas funcionen con mayor eficacia. Al reducir la viscosidad, las altas concentraciones de sal facilitan un procesamiento posterior más fluido y mejoran la eficiencia general del flujo de trabajo. La saltonasa, una endonucleasa activa en sal, está específicamente diseñada para un rendimiento óptimo en condiciones de alta concentración de sal, facilitando la escisión eficiente del ADN en fragmentos de 3 a 5 nucleótidos, lo que la convierte en una solución segura para la producción de vectores virales.

Procedimiento

- nivel de contaminación de ácidos nucleicos
- temperatura de incubación
- tiempo de incubación
- concentración de sal
- y otros compuestos presentes en la mezcla de reacción.

- NaCl: 500 mM (Nota: La saltonasa requiere un mínimo de 150 mM de NaCl para aumentar su actividad)
- MgCl 2 : 5 mM (Nota: Se requieren un mínimo de 2 mM de iones Mg²⁺ para activar la Saltonasa)
- pH: 8,5 (o inferior, como 7,4)
- Temperatura: 37°C (o inferior, como 23°C)

Control de calidad

La actividad enzimática se mide en un volumen de reacción de 1,575 mL que contiene ADN de esperma de arenque como sustrato, incubado durante 30 minutos a pH 8,5 a 37 °C con una enzima que degrada el ADN a oligonucleótidos solubles en ácido. Una U de la enzima provoca un aumento de la absorbancia a A260 de 1,0.

La pureza de Saltonase MBG es ≥ 95%, según lo evaluado por electroforesis SDS-PAGE. La pureza de Saltonase GMP es ≥ 99%, según lo evaluado por HPLC y electroforesis SDS-PAGE.

La actividad de la proteasa se mide mediante la incubación de 10 µg de BSA con 10 µg de enzima durante 20 horas a 37 °C. Los resultados se visualizan en un gel de poliacrilamida. No se detectó degradación de la mezcla de proteínas, según se determinó mediante SDS-PAGE con detección de azul de Coomassie.

La carga biológica se mide de acuerdo con Ph Eur 2.6.12. Examen microbiológico de productos no estériles (recuento total de aerobios viables).

Endotoxinas: reacción LAL automatizada con el sistema CHARLES RIVER Endosafe®nexgen-PTS™. La prueba de endotoxinas bacterianas se utiliza para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegativas mediante lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). La técnica cromogénica se basa en la coloración tras la escisión del complejo péptido sintético-cromógeno.

Uso

La concentración final óptima de Saltonasa en una reacción depende de varios factores:

Recomendamos establecer la concentración de enzima entre 20 y 50 U/mL, considerándose óptimas las siguientes condiciones:

Aplicaciones

- Producción de vectores virales de terapia génica (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, lentivirus, virus oncolíticos)
- Producción de partículas similares a virus (VLP)
- Purificación de proteínas y enzimas recombinantes
- Reducción de la viscosidad y prevención de agregados de ADN durante la etapa de lisis celular.
- Eliminación de contaminación no deseada de ácidos nucleicos en reactivos de biología molecular en sistemas exigentes

Esto se utiliza para aplicaciones como: