Product Description
Uracilo ADN glicosilasa (5,0 mL a 2000 U/mL) y tampón de reacción UDG 10x (3 x 1,5 mL).
Características
- Elimina el uracilo del ADN.
- No exhibe actividad medible en oligonucleótidos cortos (<6 bases) y sustratos de ARN.
Detalles del producto
La uracilo-ADN glicosilasa cataliza la hidrólisis del enlace N-glicosílico entre el uracilo y el azúcar, dejando un sitio abásico en el ADN monocatenario o bicatenario que contiene uracilo. La enzima no muestra actividad medible en oligonucleótidos cortos (<6 bases) ni en sustratos de ARN.
Esta enzima se suministra en 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.
El tampón de reacción UDG 10x contiene 200 mM Tris-HCl, 10 mM DTT y 10 mM EDTA; pH 8 a 25°.
Actuación
Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 100 U
Exonucleasa bicatenaria: 100 U
Endonucleasa bicatenaria: 100 U
Contaminación por ADN de E. coli: 100 U
- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 25.693 Daltons
Principio
La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen de la uracilo ADN glicosilasa de E. coli K-12.
Una unidad se define como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1,8 nmol de uracilo en 30 minutos a partir de ADN bicatenario, tritiado y que contiene uracilo a 37 °C en tampón de reacción UDG 1x.
Procedimiento
Instrucciones de uso
1. Utilice el tampón de reacción UDG incluido a 1x. Esta enzima es activa en la mayoría de los tampones de reacción de biología molecular, por lo que no es necesario cambiarlos. 2. Añada 0,5 µL de UDG a una reacción con sustrato de ADN con uracilo (hasta 0,1 µg) para obtener una reacción total de 20 µL. 3. Incube a 37–50 °C durante 30 minutos.
Nota: Calentar a 95 °C durante 10 minutos solo inactiva parcialmente la enzima. Si se requiere una inactivación completa, se debe añadir un inhibidor de la uracilglicosilasa o limpiar la reacción con métodos adecuados. Se recomienda el uso de UNG termolábil (G5030L) si se desea una inactivación rápida y completa de UDG a bajas temperaturas.
Nota: El protocolo se puede modificar para el uso específico de la aplicación.
Control de calidad
La actividad específica se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1x y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían un producto de PCR 3H-dUTP y tampón de reacción UDG 1x. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante un método de precipitación con TCA.
La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.
La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.
La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.
Aplicaciones
- Prevención de arrastre en PCR
- Creación de sitios abásicos que contienen ADN monocatenario o bicatenario
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
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