Qiagen, G5020L, UDG termolábil (500 U)

500 U de UDG termolábil (0,5 mL a 1000 U/mL) y tampón de reacción UDG termolábil 10x (2 x 1,5 mL).

Características

- Elimina el uracilo del ADN, dejando un sitio AP
- Inactivado mediante una incubación de 10 minutos a >50°C
- Sin actividad en sustratos de ARN

Detalles del producto

La UDG termolábil elimina el uracilo del ADN hidrolizando el enlace N-glicosílico entre la desoxirribosa y la base, dejando un sitio apurínico o apirimidínico. No muestra actividad en sustratos de ARN, lo que la hace utilizable para RT-PCR. Esta enzima (1–10 unidades) se inactiva completamente tras una incubación de 10 minutos a temperaturas superiores a 50 °C en el tampón de reacción 1x, según lo medido en el ensayo de caracterización de unidades.

Esta enzima se suministra en 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.

El tampón de reacción 10x contiene 700 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 10 mM de EDTA y 1 mg/mL de BSA; pH 8 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 10 unidades
Exonucleasa bicatenaria: 10 unidades
Endonucleasa bicatenaria: 5 unidades
Contaminación por ADN de E. coli: 5 unidades

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 26,218 Daltons

Principio

La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen de la uracilo ADN glicosilasa termolábil recombinante aislado de una bacteria marina.

Una unidad es la cantidad de UDG termolábil necesaria para liberar 1 nmol de uracilo del ADN que contiene dU en una hora a 37 °C.

Notas:

Si se realizan ensayos repetitivos de gran volumen, se puede obtener beneficios al agregar uracil-ADN glicosilasa (UDG) a su flujo de trabajo para excluir la contaminación por arrastre.

Los experimentos de PCR se realizan utilizando dUTP en la mezcla de nucleótidos y se incuban con UDG antes de la amplificación por PCR. El UDG elimina el uracilo del producto de PCR, de modo que, en cada nueva reacción, los productos residuales se digieren y se evita su amplificación, mientras que las plantillas de ADN no se ven afectadas. Esto evita la contaminación por arrastre de PCR, qPCR y RT-PCR, que produce resultados falsos positivos.

Anteriormente, las temperaturas de síntesis de ADNc estaban limitadas por las temperaturas óptimas de reacción de las transcriptasas inversas de generaciones anteriores. La configuración a baja temperatura de 50 °C en el paso de síntesis de ADNc provoca un retraso en los valores de C q debido a que el ADN recién amplificado que contiene dUTP es escindido por UDG. Los usuarios deben elegir entre prevenir la contaminación por arrastre, retrasar la C q, arriesgarse a la contaminación por arrastre y mantener los valores de C q.

El uso de un paso de síntesis de ADNc elevado a 55 °C mantiene los valores de Cq. La enzima StableScript tiene una temperatura de reacción óptima de 50 a 65 °C y se acopla bien con la enzima termolábil UDG (G5020L).

Procedimiento

Utilice el tampón de reacción UDG incluido a 1x. Esta enzima es activa en la mayoría de los tampones de reacción de biología molecular, por lo que no es necesario cambiarlos.
- Agregue 0,5 µL de UDG (G5020L) a una reacción con sustrato de ADN que contenga uracilo (hasta 0,1 µg) en una reacción total de 20 µL.
- Incubar a 25–37°C durante 30 minutos.
- Esta enzima puede inactivarse completamente mediante una incubación de 10 minutos a temperaturas superiores a 50°C.

Instrucciones de uso

Nota: El protocolo se puede modificar para el uso específico de la aplicación.

Control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en un tampón de reacción 1x (Tris-HCl 70 mM, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM, 100 µg/mL de BSA: pH 8,0 a 25 °C) y se añadieron a reacciones que contenían un producto de PCR de 1,1 kb marcado con 3H-dUTP en tampón de reacción 1x. Las reacciones se incubaron durante 60 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante un método de precipitación con TCA.

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

La termolabilidad se examinó mediante el tratamiento térmico de 10 unidades de enzima durante 10 minutos a 50 °C en un tampón de reacción 1x. La enzima se transfirió a reacciones que contenían un producto de PCR de 3H-dUTP de 1,1 kb y la actividad se midió como se describe en el ensayo de caracterización de la unidad. Tras el tratamiento térmico, la actividad remanente fue inferior al 0,5 %.

Aplicaciones

- Prevención de arrastre para PCR
- Elimina el uracilo del ADN.

- Lindahl, T. y otros (1977) J. Biol. Chem., 252, 10, 3286-3294.
- Longo, MC y otros (1990) Gene, 93, 125-128.

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias