Qiagen, G5030L, termolábil UNG (250 U)

250 U de UNG termolábil (0,25 ml a 1000 U/mL)

Características

- Elimina el uracilo del ADN, dejando un sitio AP
- Sin actividad en sustratos de ARN
- Completamente inactivado por calor mediante una incubación de 10 minutos a > 50 °C
- Alta actividad específica y fuerte actividad a temperatura ambiente.

Detalles del producto

La adición de UNG en PCR, qPCR y RT-PCR puede prevenir la contaminación por arrastre, que provoca resultados falsos positivos. Los clientes que realizan ensayos repetitivos de gran volumen pueden beneficiarse de la incorporación de UNG a su flujo de trabajo. Es compatible con la mayoría de los tampones de reacción de PCR y RT-PCR y es activo en una amplia gama de tampones.

Este producto es una versión mejorada en comparación con el UDG termolábil (G5020L).

Se suministra en: 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50 % glicerol, pH 7,5 a 25 °C

Actuación

Prueba: Especificaciones
Pureza SDS: >95%
Exonucleasa monocatenaria: <1,0%
Exonucleasa bicatenaria: <1,0%
Contaminación del ADN de E. coli: <10 copias

Propiedades: Temperatura de almacenamiento: –25 °C a –15 °C Peso molecular: 51.727 Daltons

Principio

Las uracilo-ADN-glicosilasas (UDG) son una superfamilia de enzimas (con seis subfamilias) que reparan el ADN. La uracilo-N-glicosilasa (UNG) pertenece a la familia 1 de la superfamilia UDG, lo que hace referencia a UNG en el gen. Tanto la UDG como la UNG realizan la misma función biológica: eliminar el uracilo del ADN.

Fuente de proteína: Una cepa de E. coli que porta un gen de uracilo -N-glicosilasa termolábil clonado

Definición de la unidad: 1 unidad se define como la cantidad de UNG 2.0 termolábil necesaria para liberar 1 nmol de uracilo del ADN que contiene dU en una hora a 37 °C.

Procedimiento

Paso*: °C
Tratamiento UNG: 25
Transcripción inversa: 50
Inactivación RT y desnaturalización inicial: 94
Desnaturalización: 94
Recocido/Extensión: 60

- Siga las pautas estándar del ensayo de PCR

- Pipetear suavemente
- Mezclar bien
- Centrifugue la placa rápidamente antes de cargarla en el instrumento.

Instrucciones de uso:

2. Configure su reacción de PCR cuantitativa según el protocolo existente. El UNG termolábil (G5030-1000) es compatible con la mayoría de los tampones de reacción de PCR y RT-PCR.

3. Añada 1 µL de UNG termolábil (G5030-1000) por cada 50 µL de mezcla maestra y agite vigorosamente. La tabla a continuación muestra un ejemplo de configuración de una reacción de RT-qPCR de un solo paso utilizando una transcriptasa inversa RNasa H-min (como Enzscript P7600L o StableScript P7720L) y una ADN polimerasa Taq de inicio en caliente basada en anticuerpos (como nuestra Phoenix Hot Start Taq P7590L).

*La temperatura y el tiempo óptimos para la transcripción inversa, la inactivación de RT y la activación de Taq, así como las condiciones de anexión/extensión, deben ser determinados por el usuario final.

Notas: El tratamiento de la reacción con UNG durante 2 minutos a 25 °C al inicio del ciclo térmico elimina los residuos de uracilo del ADN que contiene dU, impidiendo que sirva como molde. El UNG termolábil puede inactivarse rápidamente por calor durante la transcripción inversa a temperaturas de al menos 50 °C durante 10 minutos.

Análisis de control de calidad:

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en un tampón de reacción 1X (Tris-HCl 70 mM, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM, 100 µg/mL de BSA, pH 8,0 a 25 °C) y se añadieron a reacciones que contenían un producto de PCR de 1,1 kb marcado con 3H-dUTP en tampón de reacción 1X. Las reacciones se incubaron durante 60 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante un método de precipitación con TCA.

La concentración de proteína (OD 280) se determina mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de la detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Prevención de arrastre en PCR
- Creación de sitios abásicos que contienen ADN monocatenario o bicatenario

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: