Qiagen, L6010L, ligasa de ADN T3 (900.000 U)

900.000 U de ADN ligasa T3 (3.000.000 U/ml) y tampón de ligación rápida 2x

Características

- Une los extremos romos y cohesivos.
- Repara mellas monocatenarias en ADN dúplex
- Cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5ʹ y un extremo hidroxilo 3ʹ en el ADN dúplex.
- Mayor tolerancia a la sal en comparación con la ADN ligasa T4

Detalles del producto

La ADN ligasa T3 cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo fosfato 5' y un extremo hidroxilo 3' en el ADN dúplex. La enzima une extremos romos y cohesivos, y repara mellas monocatenarias en el ADN dúplex. En ausencia de un 20-30 % de PEG 6000, la ADN ligasa T3 muestra una eficiencia muy baja para la ligación de extremos romos. Es más eficiente para unir salientes A y T que extremos coincidentes con C y G. Conserva el 95 % de su actividad en NaCl o KCl 1,0 M, con una concentración óptima de 300 mM, lo que la hace recomendada para reacciones con concentraciones elevadas de sal.

Esta enzima se suministra en 20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.

El tampón de ligadura rápida 2x contiene lo siguiente: 132 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 2 mM DTT, 2 mM ATP al 15 % PEG 6000; pH 7,6 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 30.000 U
Exonucleasa bicatenaria: 30.000 U
Endonucleasa bicatenaria: 30.000 U
Contaminación por ADN de E. coli: 30.000 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 37.350 Daltons

Principio

La proteína enzimática recombinante es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen de la ADN ligasa T3.

Una unidad se define como la cantidad de ADN ligasa T3 necesaria para ligar el 50% de fragmentos de ADN de 100 ng con extremos cohesivos en 30 minutos a 23 °C.

Procedimiento

- 10 µL de tampón de ligadura rápida 2x (B1010)
- 50 ng de ADN vectorial
- Exceso molar de 3 veces del ADN insertado
- 1 µL de ADN ligasa T3 (L6010)
- Agua libre de nucleasas hasta 20 µL

- pH óptimo: 8.0
- Temperatura óptima de reacción: 20°C
- Tiempo de reacción óptimo: >30 minutos (sin PEG 6000)
- Fuerza iónica óptima: 300 mM NaCl
- Catión divalente óptimo/concentración: 2 mM Mg 2+
- Cofactor óptimo: ATP (0,5 mM)

Instrucciones de uso

Ligadura de extremos adhesivos del vector cortado y el inserto.

Relación molar de ADN recomendada, vector: inserto = 1: 3

1. Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 µL (agregue la ligasa al final):

2. Incubar la mezcla de reacción a 25°C durante 15-30 minutos.

3. Deje el producto ligado en hielo y transforme de 1 a 5 µL del producto en 50 µL de células competentes. Alternativamente, el producto de la ligación puede purificarse mediante el método adecuado o almacenarse a -20 °C.

Notas

1. La ADN ligasa T3 se suministra con tampón de ligación rápida 2x para su uso en reacciones de ligación. Su actividad es muy baja en ausencia de PEG (1).

2. La inactivación por calor reduce drásticamente la eficiencia de la transformación.

La enzima también se ha caracterizado en el tampón 1x T3 DNA Ligase, con una disminución de 17 veces en la actividad específica debido a la ausencia del agente de aglomeración (PEG 6000).

El tampón de ADN ligasa T3 1x contiene 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0,5 mM ATP y 1 mM DTT; pH 8,0 a 25 °C.

La siguiente información se tomó de la referencia de Cai (Cai, Liang, et al. (2004) J. Biochem. 135:397), que describe la caracterización de la ADN ligasa T3:

Control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en tampón de ligación rápida 1x y se añadieron a reacciones de 20 µL que contenían fragmentos de ADN bicatenario y tampón de ligación rápida 1x. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 23 °C, se colocaron en hielo y se analizaron en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Ligadura de clonación
- Sellado de nitidez en ADN bicatenario

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias

1. Cai, L. et al. (2004) J. Biochem., 135, 397-403.